基因修饰在人源化肝脏小鼠建模中的应用PPT课件

,基因修饰技术在人源化肝脏小鼠模型中的应用,1,早在17世纪动物试验就已经出现了。目前试验动物广泛应用于生理学、医学、药学等学科的教学与研究，以及食品、化妆品、生物制品、工业产品等的安全性、毒性和效力等方面的试验和检测，具有重要价值和作用。,试验用动物,2,种属差异,动物基因组,人类基因组,代谢、免疫相关人类毒性,3,肝脏是人体最重要的代谢器官，也是出现受试人员中毒时最常见、表现最明显、影响最严重的毒性靶器官。另据报导，每年临床发生肝毒性损伤的病例亦非常多。药物引发肝损伤占全部中毒事件20%50%，暴发性肝衰竭可达15%30%。,药物性肝损害,4,非阿尿苷事件回顾,非阿尿苷是抗乙肝病毒核苷类似物，其前期试验药效显著，结果良好。而1993年15名受试者加大剂量（0.1 or 0.25 mg/kg/d)）的二期临床试验中，前8周疗效明显，而13周时7名受试者出现肝衰竭、脾衰竭、乳酸中毒，其中5名不治身亡。,5,动物试验非阿尿苷最大耐受剂量,小鼠50mg/kg/d90d,大鼠500mg/kg/d30d,比格犬3mg/kd/d90d,食蟹猴25mg/kg/d30d,小鼠给药剂量达到250mg/kg/d（人类剂量1000倍）时，50只小鼠仅有4只死于肾衰竭。大鼠剂量达510mg/kg/d （人类剂量2000倍），持续给药70d，所有大鼠ALT、AST均正常。,6,试验动物作为预测工具如不能完全准确预测人体可能会出现的情况，就如同战地扫雷，一旦出现误判，代价很有可能将是巨大的！,危险,安全,7,那么能不能构建一种临床前更贴近人肝代谢、预测性更一致性的试验动物模型，将可能发生的人类肝毒性提前筛查出来，降低无谓成本，减少临床损失呢？这将具有极其重大的意义和价值！,人源化肝脏小鼠模型由此成为研究热点,8,现代生物医药领域研究模式,基因修饰技术ES打靶基因修饰技术TALEN基因修饰技术CRISPR/Cas9基因修饰技术TetraOneTM基因修饰技术,基因修饰动物建模,9,免疫缺陷小鼠模型的构建,10,人源化肝脏小鼠模型的构建,工程基因片段uPA基因片段Fah基因片段HSVtk/GCV自杀系统Tet-on/uPA自杀系统其他,移植用人类细胞肝细胞造血干细胞胸腺细胞其他,11,（1）uPA-Rag2小鼠（Dandri，2001年，德国）,uPA全称尿激酶纤维蛋白溶酶原活化子（Urokinase-type Plasminogen Activator），当白蛋白启动的uPA基因片段在小鼠肝细胞内表达时，纤维蛋白溶酶原会激活纤维蛋白酶，诱发粗面内质网发生裂解损伤，最后肝细胞损伤并逐渐消亡。 Rag2全称重组激活基因2（Recombination-Activating Gene2），在VDJ基因重排和淋巴细胞发育中起关键性作用。Rag2-/-小鼠为C57BL/6J品系背景，T、B淋巴细胞早期发育严重停滞，外周血没有成熟的循环T、B淋巴细胞，非特异性免疫收影响小。,Rag2小鼠,uPA基因,肝细胞人源化率仅有15%，适合病毒学研究，但无法满足代谢研究需求！,12,（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）,SCID小鼠全名联合缺陷免疫小鼠 （severe combined immune deficiency）， 其第16对染色体隐性基因突变，纯合子的 淋巴细胞抗原受体基因VDJ区域的重组酶活性异常，基因重排无法正常进行，影响B、T细胞的正常分化，外周血白细胞总数减少，但粒细胞、巨噬细胞、NK细胞、LAK细胞正常。 uPA-SCID小鼠相比uPA-Rag2小鼠具有更高的人源化比率，其肝细胞替换可达50%，运用免疫抑制剂后可提升至70%，基本满足代谢和毒性研究需求，许多学者利用该模型进行了多种药物研究。,SCID小鼠,uPA基因,13,持续性自发肝损；出血性疾病导致死亡；高血补体浓度（C3）肾病；生殖障碍；移植窗较小（出生后2W内移植）；存在非特异性免疫，需药物抑制免疫。,（2）uPA-SCID小鼠（Tateno，2004年，日本）,14,（3）Fah小鼠（Grompe，1993年，波兰）,Fah全称延胡索酰乙酰乙酸水解酶基因（fumarylacetoacetatehydrolase），Fah-/-小鼠酪氨酸代谢受阻，出现型酪氨酸血症，毒性产物损伤肝、肾。2-硝基-4-三氟甲苯-1,3环乙烷碘（NTBC）可以抑制酪氨酸降解通路中4-对羟基苯丙酮酸双氧化酶（4-HPPD）活性，减少毒性代谢产物积聚，起到治疗作用。,NTBC治疗维持,具有免疫系统，不适合人源化组织和细胞移植,15,Fah/nude,Fah/Rag1,Fah/Nod/Scid,ll2rg基因是白细胞介素2受体的gamma链（Il-2R c，又称CD132)，是具有免疫功能的细胞因子Il-2、Il-4、Il-7、Il-9、Il-15和I-21的共同受体亚基。 L2rg-/-小鼠机体免疫功能严重降低，尤其是NK细胞的活性几乎丧失。,（4）FRG小鼠（Azuma，2007年，波兰）,16,持续性的自发肝脏；自发性型酪氨酸血症突出，易诱发肝癌；需要药物NTBC控制肝损伤程度，易对试验结果造成影响；小鼠存活率不高，饲养时易死亡。,（4）FRG小鼠（Azuma，2007年，波兰）,FRG小鼠在性状和效果上都优于Fah-/-小鼠，其肝细胞替换率达80%以上，后经其他学者改进探索，可达95%左右。该模型应用于代谢和病毒等多个领域研究，有重要意义。,17,（5）NOG、NSG小鼠（Ito，2002年，日本）,NOG小鼠由日本实验动物研究所的Ito培育而成。通过杂交NOD/Scid和Il2rg-/-小鼠而来，其T、B细胞皆缺失，NK细胞功能缺陷。与NOD/Scid小鼠相比，NOG小鼠的人体细胞和组织移植存活率显著提高，同时能够植入更高比例的正常或癌变人类细胞和组织。NOG、NSG是类似的并行品系，源于日本为NOG（NOD/Shi-scid/Il-2Rcnull），源于美国为NSG（NOD/scid/C/SzJ）。 NOG小鼠在免疫缺陷模型、肿瘤模型、异种移植模型、传染病模型领域有大量应用。,18,（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，2011年，日本）,单纯疱疹病毒胸苷激酶/更昔洛韦（HSVtk/GCV）系统是分子生物学基因修饰技术中运用十分广泛的自杀系统，GCV本身无毒，但是在转染了HSVtk基因的细胞中可被磷酸化，成为单磷酸盐，再经内源性细胞激酶作用可转化为二磷酸和三磷酸盐，对细胞有高毒性。,NOG,TK-NOG,19,具有人肝等效的酶表达及生物功能；具有较高立体组织结构；人源化程度高（90%）；生存率高，移植时段宽裕，可重复利用；无需外源性药物维持性状；可生殖传代（雌性可与NOG小鼠生育）；在代谢、毒性、病毒、微生物方面大量应用 2011-2017，美日有诸多研究和数据。无商业化成品供应，国内来源受限！,（6）TK-NOG小鼠（Hasegawa，2011年，日本）,20,（7）uPA-NOG小鼠（Gutti，2014年，美国）,uPA-NOG小鼠是在NOG小鼠基础上通过基因修饰加入uPA基因培育而来，目前应用相对较少，有报导的文献显示仅