细胞培养课件

动物细胞培养,前言,1885年Roux最早尝试使组织离体培养，材料是鸡胚神经板，采用生理盐水为培养液，并首次采用组织培养这个术语。1907年Harrison 和1912年Carrel开始把组织培养作为一种方法，用于研究离体动物细胞的培养。由于组织培养在医学研究中的应用，如抗病毒疫苗的生产等，现已经逐渐发展成为一门精细技术。许多细胞株、细胞系的培育成功，尤其是以人的肿瘤组织为材料建立的各种细胞系，如Hela细胞系（Gey，1952），可用来进行一系列研究，更加促进了组织培养技术的发展。,细胞培养中热门的研究领域,1)细胞内部的活动，如DNA的复制和转录、蛋白质合成、能量代谢；2)细胞内部的流动，如RNA从细胞核向细胞质方向运转，激素受体复合物的易位等；3)生态学，如营养、感染、病毒或化学诱变、药物作用；4)细胞与细胞之间的相互作用，如胚胎诱导、细胞群体的动力学等。,离心机,橱柜,实验台,冰箱,培养箱,试剂柜,实验仪器台,超净工作台,实验台,实验台,实验台,实验台,水池,冰箱,衣柜,实验台,显微镜,递物窗,缓冲间,无菌操作室,准备室,1.细胞培养室设置,细胞培养前的实验准备,下风口,上风口,无菌操作室,超净工作台和CO2培养箱,2.细胞培养的主要实验设备,超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境。,CO2培养箱设定的条件为37 ，5CO2 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题：用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。保持培养箱内空气干净。定期消毒箱内蒸馏水槽中预留灭菌蒸馏水，以保持箱内湿度，避免培养液蒸发。,解剖显微镜,倒置显微镜,2.细胞培养的主要实验设备,滤 器,自动双重纯水蒸馏器 纯水仪,酶标仪 微孔板震荡器,培 养 板,培养瓶,3.细胞培养的主要试剂,基础培养基（人工合成）：干粉培养基DMEM 、-MEM、RPMI1640,血清（天然成分）,抗菌素：通常是青霉素和链霉素联合使用，使用浓度为100U/ml,消化液：常用0.25胰蛋白酶，使细胞脱离组织或容器壁， 用含血清培养液中止其活性平衡盐溶液:常用的有PBS，Hanks等缓冲系统：常用为HEPES有机补充物：如丙酮酸钠， 谷胺酰氨等。促细胞分裂因子：如生长因子类的FGF(成纤维细胞生长因子)，EGF(表皮生长因子)。贴壁和铺展因子：如胶原蛋白，纤粘蛋白等。可根据培养细胞的特殊要求进行添加。水：高纯度的去离子水,培养基,天然培养基：天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。优点：营养成分丰富，培养效果好缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染,合成培养基:合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。,血清,血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56 ，30 分钟血清的消毒：过滤除菌血清的使用浓度为520,细胞培养(cell culture)是指细胞的离体培养，是在无菌条件下，把动物或植物的细胞从机体中分离出来，置于培养皿中，并在一个合适的环境中，给以营养物质，使之继续生存和繁殖的方法。,细胞培养（Cell Culture）,细胞培养的基本概念,原代培养(primary culture)，或称为初代培养，就是从供体取下组织细胞后在体外进行的首次培养，中途不分割培养物。常用的原代培养方法有组织块培养法和消化培养法。,原代培养（Primary Culture）,传代培养（Secondly Culture）,传代培养(secondly culture)，在原代培养物铺展为单细胞层后，将原代培养细胞分开接种到两个或多个新的培养瓶中继续培养增殖。,如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？,遗传物质未改变,遗传物质改变,多数组织细胞固定在表面生长和分裂。,培养细胞的类型,贴附型成纤维样细胞型上皮样细胞型 悬浮型 如癌细胞,培养人真皮成纤维细胞,培养人口腔上皮细胞,培养的骨髓瘤细胞,贴附型细胞的生长特性,细胞的贴壁生长 接触抑制 细胞的生长曲线,细胞贴壁延展过程(模式图),细胞的接触抑制现象,正常培养细胞的生长曲线,退化死亡,平台期,细胞数增大极限点，出现接触抑制,细胞指数生长极限点,指数生长期,潜伏期,细胞数量,0,24,48,72,96,120,小时,指数生长期是最佳实验期 !,实验准备 取材、分离细胞 原代培养 维护培养,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,着装,操作者进入无菌室前先用肥皂洗净双手，然后用1 新洁尔灭浸泡消毒5分钟,原代培养的一般流程,原代培养的一般流程,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,将小白鼠断颈处死，然后用75%酒精或1 新洁尔灭浸泡消毒，迅速进入无菌室。,用眼科剪和镊，将肾外膜剪破，并将其剥向肾门，去肾外膜及脂肪,实验准备 取材、分离细胞 原代培养 维护培养,实验准备 取材、分离细胞 原代培养 维护培养,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,原代培养的一般流程,组织块培养法,原代培养方法,消化法,原代培养流程图：组织块法,原代培养流程图：组织块法,原代培养流程图：消化法,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,（一）获取小鼠胚胎,1.将8周龄的昆白鼠和12周龄的昆白按1:1比例合笼。次日晨10:00前观察鼠阴道口，有乳白色或蛋黄色胶冻状物（阴道栓）即定为怀孕0.5天；2.断颈处死孕13.5天的母鼠，置于蜡盘上。75酒精消毒后，用普通剪刀和镊子剪开下腹皮肤，并用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮。用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。3.在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的平皿中，洗涤数次。将子宫移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。将胎鼠移入另一盛有PBS的平皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的平皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,（二）分散细胞,1.将干净的鼠胚躯干移至干净的培养皿内（一般6个鼠胚躯干装1皿，视大小而定），用眼科直剪充分剪碎，剪成约1mm3以下的碎块。2.用1ml的移液器每皿加入3ml的PBS，混匀，静置30sec，用移液器吸去上清液；向装有鼠胚碎块的培养皿内加入1ml0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA混合消化液，用1ml移液器轻轻吹吸30秒，可见组织块变得较为粘稠，缓慢摇动培养皿2-5min后利用倒置显微镜观察组织块变透明，并有单细胞脱离时即可进行组织块半消化的原代培养；3.留小部分鼠胚碎块于培养皿中用于组织块半消化原代培养，其余移至一尖底离心管中，置37水浴摇动消化15-20min，用于细胞计数及细胞冻存实验；4.培养皿中立即加入1ml含50%新生牛血清的PBS，吹打混匀，以终止酶的作用；离心管消化结束后，静置5min，用移液器小心将上清液转移到另一离心管中，并加入1ml含50%新生牛血清的PBS中，吹打混匀，以终止酶的作用， 1000rpm离心5min，弃上清，沉淀即为分散的鼠胚成纤维细胞,小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养,（三）接种培养,用移液器吸去培养皿中的多余液体加入适量含20%新生牛血清的DMEM培养液，将组织块转移至新的培养皿（瓶）中，并均匀分布在培养皿（瓶）的底部，做好标记（日期、名称、编号），放入37，5CO2，100相对湿度的培养箱中培养。细胞沉淀用适量含20%新生牛血清的DMEM培养液重新悬浮；利用血球计数板计数，调节细胞密度为105个/ml，计算细胞的存活率（具体实验步骤见“细胞计数与活力检测”部分）；剩余细胞悬液用于细胞冻存实验（具体见“细胞的冷冻保存”部分）3. 第2-3天可以观察，组织块半消化原代培养可见组织碎块附着于培养瓶（皿）底部，周围细胞呈放射状生长，此时可见有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。,小鼠胚胎成纤维细胞原代培养,细胞的传代培养,将原代培养物分割后重新接种到两个或多个培养瓶内进行培养，这一操作称为传代培养,传代比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异.细胞传代培养的意义传代时机的把握传代培养的代数限制；少数细胞可出现永生化,每一代培养细胞的生长过程分期,退化死亡,平台期,细胞数增大极限点，出现接触抑制,细胞指数生长极限点（MI、细胞群体倍增时间）,指数生长期,潜伏期,细胞数量,0,24,48,72,96,120,小时,吸去旧液,加入消化液解离细胞约5min,在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状,细胞的传代培养：贴附型,PBS洗 涤12次,吹打悬浮细胞,调整细胞密度,分装接种，置于CO2培养箱中继续培养,在培养瓶中加入适量含血清培养液,培养细胞的观察,细胞的传代培养：贴附型,培养细胞的观察,培养液颜色、是否清亮,培养细胞的状态,细胞的传代培养：贴附型,吸去旧液,加入消化液解离细胞约5min,在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状,PBS洗 涤12次,吹打悬浮细胞,调整细胞密度,分装接种，置于CO2培养箱中继续培养,在培养瓶中加入适量含血清培养液,培养细胞的观察,吸去旧液,加入消化液解离细胞约5min,在倒置显微镜下观察，细胞呈圆粒状,细胞的传代培养：贴附型,PBS洗 涤12次,吹打悬浮细胞,调整细胞密度,分装接种，置于CO2培养箱中继续培养,在培养瓶中加入适量含血清培养液,培养细胞的观察,中止消化、吹散细胞,离心，收集细胞,细胞计数，调节密度,按比例分割，接种至新培养瓶,细胞的传代培养：悬浮型,细胞培养中应注意的几个问题,1）培养液和培养物的比例：一定浓度的培养液仅能支持一定数量的细胞生长，不能盲目增加每单位体积的细胞浓度。2）PH：初培养pH应为7.4，培养过程应不低于7.0。3）培养瓶内的空间：一般培养瓶内培养液与液面上的空间体积之比为1:10。,4）容积、深度、表面面积：培养液体积与表面面积的比例为0.20.5ml/cm2。需高浓度氧的，在浅的培养液（2mm）中生长较好；需要低浓度氧的。在深的培养液（5mm）中生长较好。5）去除死细胞6）温度控制：动物细胞培养对温度波动的敏感性很大。温度低于36.5，细胞生长缓慢；温度高于37.5，细胞存活力降低。,细胞培养中应注意的几个问题,培养细胞的污染问题及检测,细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。,细胞污染的种类和判定,细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：1) 培养液的酸碱度发生异常的改变。2)培养液出现混浊。3)光镜观察到菌丝和颗粒。4)细胞出现死亡或增殖缓慢等。,污染物的检测,1.细菌和真菌污染的检测：1）涂片染色镜检；2）接种培养：Trypticase大豆肉汤、BHI、Thioglycocollate肉汤和血琼脂板适于广泛的细菌检测；Sabouraud肉汤、YM肉汤和营养肉汤适于检测真菌。 检测到阳性结果后，应高压灭菌处理污染的培养物及其用具。,真菌感染,细菌培养液被洋葱佰克霍尔德菌污染了。洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌。,白色念珠菌污染,2.支原体检测: 支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰病毒的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。,污染物的检测,支原体检测方法和处理,1）荧光技术检测：支原体含有DNA，能与一种荧光染料Hoechest 33258特异性的结合，可根据细胞表面的荧光来显示细胞是否污染有支原体。2）直接培养法：实验室常用。3）放射自显影检测：4）DNA分子杂交： 检测完毕后，所有实验用具均应经过高压消毒处理。,支原体检测方法和处理,5）污染支原体后的处理： 抗生素处理：如加入泰乐菌素等。 共培养法：与巨噬细胞共培养。 重新克隆法：抗生素处理后，将细胞稀释后传代，每周换2次含抗生素的新鲜培养液，45周后，重复克隆2次。 过滤法：0.22m孔径滤膜正压过滤。,支原体污染电镜照片, 煎蛋状和其他形状,污染病毒的检测,1）致细胞病变效应（CPE）或集落的检测：采用相差显微镜检测2）血细胞吸附试验；3）鸡胚接种。,细胞间交叉污染,为避免细胞间交叉污染，应注意：了解各细胞系的特征；培养各细胞系的操作手续要快速；培养各细胞系不用同一瓶的培养液和酶等；吸过培养液和细胞悬液的吸管，不能放回储存培养液和酶的瓶内；经常检查培养物特征，注意任何突然的形态学改变，通过染色体或同工酶谱分析，检查是否有交叉污染。,细胞保存：慢冻快融,当细胞冷到零度以下，可以产生以下变化：细胞器脱水，细胞中可溶性物质浓度升高，并在细胞内形成冰晶。 如果缓慢冷冻，可使细胞逐步脱水，细胞内不致产生大的冰晶；相反结晶就大，大结晶会造成细胞膜、纲胞器的损伤和破裂。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重结晶,低温保护剂的应用,常用的低温保护剂是DMSO，它是一种渗透性保护剂，可迅速透入细胞，提高胞膜对水的通透性，降低冰点，延缓冻结过程，能使细胞内水分在冻结前透出细胞外，在胞外形成冰晶，减少胞内冰晶，从而减少冰晶对细胞的损伤。,细胞冻存方法,1、预先配制冻存液： 含20%血清培养基10% DMSO 2、取对数生长期细胞，经胰酶消化后，加入适量冻存液, 用吸管吹打制成细胞悬液（1106 5 106细胞/ml)3、加入1ml细胞于冻存管中，密封后标记冷冻细胞名称和冷冻日期。,冷冻保存要点：,冷冻过程要缓慢。4 3060 分钟-20 30 分钟 -80 1618 小时（或过夜）液氮长期保存冻存细胞必须处在对数生长期，活力大于90，无微生物污染。细胞浓度控制在：11075107/ml。,细胞复苏方法,（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入3738 水浴中，使其融化（1分钟左右）。（2）5分钟内用培养液稀释至原体积的5-10倍以上。（3）低速离心10分钟。（4）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。,细胞计数与活力检测,在细胞群体中总有一些因各种原因而死亡的细胞，总细胞中活细胞所占的百分比叫做细胞活力。应用：由组织中分离细胞 复苏后的细胞 药物筛选方法：细胞计数、台盼兰染色、MTT法,（1）细胞计数,将血球计数板及盖片用擦试干净，并将盖片盖在计数板上。将细胞悬液吸出少许，滴加在盖片边缘，使悬液充满盖片和计数板之间。静置3分钟。镜下观察计数：数上不数下，数左不数右,细胞浓度的计算：,Volume (体积)=長 x 寬 x 深度= 1 mm x 1 mm x 0.1 mm= 0.1 mm3= 1 x 10-4 cm3 (ml),细胞密度(个/mL) = 4个大方格的细胞总数/4 10-4=4个大方格的细胞总数/4 104,（2）台盼兰排斥染色,原理：死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见兰色的细胞，活细胞不被染色，呈透明状。步骤：制备单细胞悬液，并适当稀释（105/ml）9滴细胞悬液+1滴0.4%台盼兰染液，混匀染色。吸取少许悬液涂于计数板上。3分钟内计数活细胞和死细胞,细胞数/ml（4大格细胞数之和/ 4 ）104稀释倍数细胞活力（）