临床基因扩增标本的留取及核酸提取方法ppt课件

临床基因扩增标本的留取及核酸提取方法123九十年代中期 PCR临床应用在国内全面展开1998年 荧光定量 PCR技术开始在中国应用于临床检测PCR 发展简史PCR (Polymerase Chain Reaction)1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于 12月 16日第一 次成功实验发明了 PCR1985 关于 PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事等人 在 Science 上 发 表1989 12月 Science 杂志将 PCR和它所使用的 Taq DNA聚合酶命名为第一个 “年度分子 ”。1993 Kary Mullis， Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量 PCR技术4循环次数 DNA的链数1 21 22 22 43 23 810 210 102420 220 1,048,57630 230 1,073,741,824 10亿 PCR循环次数与 DNA产量关系PCR循环PCR特点：高效扩增、忠实复制5 灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量PCR反应的特点6Ct值的意义Ct值与重复性同一样本在相同条件下同时进行 96次扩增FQ-PCRCt值与浓度不同的模板达到荧光域值时的 Ct值不同7感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 法医学鉴定法医学鉴定荧光定量 PCR的临床应用8早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证9一 感染性疾病1. 病原体含量与病情之间的关系2. 病原体含量与用药之间的关系3. 药物及疗法的研究与开发4. 新的病原体分子诊断标准5. 新的愈后指标6. 传染病发病的监控、预测与预防临床应用10临床应用二 肿瘤1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞因子、受体等2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿瘤转移基因及转移抑制基因11三 遗传病1. 等位基因检测2. 多基因遗传病的突变检测3. 基因表达异常所致遗传病检测12荧光定量 PCR在病原体检测中的应用一 肝炎病毒定量检测二 性病病原体检测三 结核杆菌及呼吸道病原体检测四 优生优育 (TORCH)相关项目检测临床应用13一 肝炎病毒定量检测HBVHCV临床应用14（一） 乙型肝炎病毒结构及特点HBsAg： 是 HBV感染的主要标志HBsAb： 保护性抗体HBcAg： 仅存于感染的肝细胞核内，一般不存在于血循环中HBcAb: 非保护性抗体， HBcAb-IgM提示 HBV处于复制状态HBeAg： HBV复制及强感染性的指标HBeAb： 有一定的保护作用，预后良好HBV15HBV（二） HBV-DNA与 “两对半 ”1. “两对半两对半 ” ：机体的免疫反应状态；：机体的免疫反应状态；2. “携带者携带者 ”、 “大三阳大三阳 ”、 “小三阳小三阳 ”等免疫学指标不能等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。反应体内病毒复制水平与感染程度。FQ-PCR：检测的是：检测的是 HBV本身的遗传物质本身的遗传物质 DNA ，是，是病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。163. 血清学指标 ( )不能排除 HBV感染 。HBV（二） HBV-DNA与 “两对半 ”HBsAg( ) HBV-DNA( )HBeAg ( )HBV-DNA( )4. 也可能出现也可能出现 HBsAg( )， HBV-DNA( )。5. HBsAb ( ) 、 HBcAb ( ) 、 HBeAb ( )三抗体阳性三抗体阳性 与与 HBV DNA 2.5 103 copy /ml 结果解释。结果解释。17HBV(三 ) HBV-DNA定量检测的临床意义3. HBV-DNA定量与预后a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者 1. HBV-DNA定量与 HBV复制水平及传染性2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效a. 专家提出 105copy /ml 发生了严重 HBV再感染6. 血液制品和献血员的筛选25病毒特点：1. 单正链 RNA病毒2. E1和 E2区基因高度变异性（一）丙型肝炎病毒特点HCV感染特点：1. HCV在血中含量极微 输血后肝炎主要致病因子 免疫学标志仅有抗 -HCV，非中和抗体，产生时间不一1. 有一部分人感染 HCV后，不产生抗 -HCV 2. 感染易于慢性化 (50-85%)3. 疫苗研制尚不成功单链 RNA26(二 ) HCV-RNA定量检测的临床意义1. 早期诊断a. 临床以 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。b. HCV感染 1-3W，即可检出 HCV-RNA的存在。c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。d. 医疗纠纷中的 “举证倒置 ”，病人入院前后进行 HCV-RNA检测。HCV27HCV(二 ) HCV-RNA定量检测的临床意义2. HCV-RNA载量与抗 -HCV滴度、 ALT水平之间的相关性。抗 -HCV滴度和 ALT异常率随着 HCV-RNA载量升高而增加 。3. HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。4. 慢性丙型肝炎长期抗 -HCV阳性，这时如果进行 HCV-RNA 定量检测可以鉴别活动性、复制程度。28二 常见性传播疾病病原体一 淋球菌（ NGH）二 沙眼衣原体（ CT ）三 解脲脲原体（ UU）四 梅毒螺旋体（ TP）五 单纯庖疹病毒（ HSV）六 乳头瘤病毒（ HPV）七 人类免疫缺陷病毒（ HIV）八 EV71 A16 通用型STD29艾滋病艾滋病是英文 AIDS（ Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文译音，全称是 “获得性