免疫学检测技术 PPT课件

免疫学检测技术一、 免疫学检验原理 抗原 -抗体反应：指抗原与相应抗体在体内、外发生高度 特异性结合 反应。由于实验所用的抗体存在于血清中，故又称血清学反应（ serological reaction) 应用： 用已知抗原检测未知抗体； 用已知抗体检测未知抗原： 定性或定量检测体内各种分子； 用已知抗体检测半抗原物质。1.特异性和交叉反应 特异性 ：一种抗原通常仅能与由它刺激所产生的抗体结合。分子基础： 抗原表位与抗体分子高变区之间空间构型的互补性。（一）抗原 -抗体反应的特点 交叉反应 （ cross reaction）性：若两种抗原分子有一个或数个相同（或相似）的决定基，则针对一种抗原的抗血清可与另一种抗原发生反应。 结合价：天然抗原分子表面一般含多种抗原决定基，可与多个抗体分子结合，为 多价 。单体形式的抗体分子有两个 Fab段，能结合两个相同的抗原决定基，为 两价 。2.比例性 比例合适：若抗原、抗体的数量比例合适，抗体分子的两个 Fab段分别与两个抗原决定基结合，相互交叉连接成 网格状复合体 ，则反应体系中基本不存在游离的抗原或抗体，此时形成肉眼可见的反应物（沉淀物或凝集物）。因此，确定反应体系中抗原、抗体的最适比例十分重要。 前带现象（ prozone）和后带现象 (postzone) v Ab过剩和 Ag过剩 抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，抗原和抗体结合是否呈现可见的反应现象，与两者的浓度和比例密切相关与两者的浓度和比例密切相关前带现象（ prozone）和后带现象 (postzone)Ab过剩和 Ag过剩 网格学说 （ lattice theory）抗体过剩 抗原过剩抗体抗体比例合适抗原抗体抗原 -抗体反应为分子表面的非共价结合，结合 虽稳定但可逆 。在一定条件下（如低 pH、 高浓度盐、冻融等），抗原 -抗体复合物可被解离。解离后的抗原和抗体仍保持原有理化特性和生物学活性。根据此特点，可借助亲和层析法纯化抗原或抗体。3.可逆性4.阶段性抗原抗体反应可分为两个阶段抗原抗体反应可分为两个阶段特异性结合阶段： 反应快，不可见。反应快，不可见。 可见的反应阶段： 反应慢，出现凝集、沉淀和反应慢，出现凝集、沉淀和细胞溶解等现象。细胞溶解等现象。 1.电解质抗原和抗体有对应的极性基团，能相互吸附并由亲水性变为疏水性。电解质的存在使抗原 -抗体复合物失去电荷而凝聚，出现可见反应，故免疫学试验中 多用生理盐水稀释抗原或抗体 。（二）、 抗原 -抗体反应的影响因素2.酸碱度抗原抗体反应的最适 pH是 6-8。3.温度最适温度为 37 。有些例外，如冷凝集素在 4 左右与红细胞结合最好， 20 以上反而解离。4.抗原和抗体的性质抗体的特异性和亲和力是决定抗原 -抗体反应的关键因素。此外，抗原理化性质、抗原决定基多寡和种类等均可影响抗原 -抗体反应。抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定基之间的结合能力亲和力 (affinity)根据抗原的性质、结合反应的现象、参与反应的成分等因素分类：1.凝集反应2.沉淀反应3.补体参加的反应4.免疫标记技术（三）、免疫学检验方法反应类型 实验技术非标记凝集反应 直接凝集试验、间接凝集试验、间接抑制凝集试验、协同凝集试验沉淀反应 液相内凝集试验、凝胶内凝集试验补体参与的反应 补体溶血试验、补体结合试验中和反应 病毒中和试验、毒素中和试验标记标记免疫反应 荧光免疫技术放射免疫技术酶免疫技术发光免疫技术金免疫技术颗粒性抗原（细菌或细胞等）与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集物，称为凝集反应 (agglutination) 。用于凝集反应中的抗原称 凝集原 (agglutinogen)。用于凝集反应中的抗体称 凝集素（ agglutinin)。凝集反应（ Agglutination Tests）1 直接凝集（ direct agglutination) ： 细菌或红细胞与相应抗体直接反应，可出现细菌或红细胞凝集现象。2间接凝集 （ indirect or passive agglutination) ： 检测针 对可溶性 Ag的 Ab3间接凝集抑制试验 (direct agglutination inhibition test)4. 协同凝集试验 （ co-agglutination test）载体为金葡菌，其细胞壁蛋白 A与 IgG 的 Fc结合，用于细菌、病毒的快速检测。妊娠免疫诊断试验 v 孕妇尿中，绒毛膜促性腺激素（ HCG）含量明显增高。（ HCG是可溶性抗原 ）v 反之，非孕妇尿中 HCG含量甚微，不足以消耗掉抗HCG抗体。 HCG检测为间接凝集试验的应用Definition:可溶性抗原 （血清蛋白、外毒素、细菌滤液等）与相应抗体结合，在一定条件下，形成出现肉眼可见的沉淀物的现象称为沉淀反应。沉淀反应（ Precipitation Tests）用于沉淀反应中的抗原称 沉淀原 (precipitonogen)。用于沉淀反应中的抗体称 沉淀素 （ precipitin) 。 v 大多沉淀反应 多用半固体琼脂凝胶作为介质进行 琼脂扩散 或 免疫扩散 ，即可溶性抗原与抗体在凝胶中扩散，在比例合适处相遇即形成可见的白色沉淀。1单向免疫扩散 (single immunodiffusion)2双向免疫扩散 (double immunodiffusion)沉淀反应单向免疫扩散(Single Immunodiffusion)v 是将一定量已知抗体混于琼脂凝胶中制琼脂板，在适当位置打孔后将抗原加入孔中扩散。抗原在扩散过程中与凝胶中的抗体相遇，形成以抗原孔为中心的 沉淀环 ，环的直径与抗原含量成正比相关。本法常用于测定血清 IgG、 IgM、 IgA 和 C 3等的含量。含抗体的凝胶 沉淀环双向免疫扩散 （ Double Immunodiffusion)v 是将抗原与抗体分别加入琼脂凝胶的小孔中，二者自由向周围扩散并相遇，在比例合适处形成 沉淀线 。如果反应体系中含两种以上的抗原抗体系统，则小孔间可出现两条以上的沉淀线。本法常用于抗原或抗体的定性 、组成和两种抗原相关性分析的检测。补体结合试验（ Complement Fixation test, CFT)敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多敏感性和特异性均较高，但该试验影响因素较多，现在已有被其它新方法取代的趋势。，现在已有被其它新方法取代的趋势。补体结合试验 (complement fixation test， CFT )将免疫溶血作为指示系统，用以检测另一反应 系统中抗原或抗体的传统方法。试验原理作用原理： 利用补体的溶细胞作用进行各种物理状态的抗原抗体测定5种成分， 3个系统反应系统（溶菌系统）： 已知 抗原 （或抗体） 与待测 抗体 （或抗原）补体 系统：指示系