细菌毒素（ppt x页）

1,细菌毒素,主讲人：关团、王浩,2,主要内容,简介 历史 细菌致病性 外毒素 内毒素,3,简介,一百年来，毒素研究工作在全世界逐步展开，获得了巨大发展，特别是和平年代以来发展更快，被称为毒素研究的新世纪，研究工作的深度日益增加。生化、免疫、遗传等最新技术都应用于毒素的研究，因此毒素研究已成了分子生物学一个极活跃的领域。毒素是细菌的主要致病因子，致病力强，对人畜健康危害甚大，无论人医、兽医、不管是在防疫还是医疗方面都日益受到重视。 毒素(toxin)：构成细菌致病因子的重要因素，包括内毒素（endotoxin）和外毒素（exotoxin）两大类。,4,历史,1888年，人类发现了第一个细菌毒素-白喉毒素，从此开拓了一个微生物学的新领域。一百年来，毒素研究工作在全世界逐步展开，获得惊人发展。大体可分为三个时期。 1900-1945继白喉毒素以后肉毒毒素、破伤风毒素、绿脓外毒素A等的发现，以及在第一次世界大战期间观察到了气性坏疽病例的病原菌也产生毒素。第二次世界大战爆发，推动了厌菌苗的研究，至魏氏“-毒素的发现，称做毒素研究的第一个里程碑。,5,1950-1975，在美、英、法、日等国形成了专门从事细菌毒素研究的小组。1953年炭疽毒素的发现看作是毒素研究的第二个里程碑，第三个里程碑则是霍乱热稳定肠毒素(CT)的发现。白喉毒素在组织培养中抑制蛋白合成是毒素研究的第四个里程碑，它为毒素的生物合成及遗传控制研究辅平了道路。 1975-1987，这一时期是毒素研究的新世纪，在各个领域例如生物合成、免疫学、分子生物学等方面都有大量科学家进行工作，其结果对现代生物学的四个方面有贡献1)基因工程技术，2)现代细胞生物学和真核细胞摄粒机制，3)单克隆抗体和细胞免疫，4)蛋白质分离纯起新技术。,6,细菌的致病性,致病性:一定种类的病原菌在一定的条件下，能在宿主体内引起感染的能力称为致病性。 致病性是细菌种的特征之一。 毒力：病原菌致病力的强弱程度，是量的概念，同一细菌的不同菌株，其毒力不一样。 毒力是菌株的特征。 毒力因子：构成细菌毒力的物质称为毒力因子 侵袭力：病原菌在机体内定殖，突破机体的防御屏障，内化作用，繁殖和扩散，这种能力称为侵袭力。,7,侵袭力,1.定殖： 细菌感染的第一步，实现定殖的前提是细菌要黏附在宿主易感组织细胞表面如：消化道、呼吸道、生殖道、尿道及眼结膜等，以免被肠蠕动、黏液分泌、呼吸道纤毛运动等作用所清除。 凡具有黏附作用的细菌结构成分，统称为黏附素。通常是细菌表面的一些大分子结构成分，菌毛、某些外膜蛋白(OMP)、磷壁酸 (LTA)等。 细胞或组织表面与黏附素相互作用的成分称为受体 ，多为细胞表面糖蛋白。,8,2.干扰或逃避宿主的防御机制,病原菌黏附于细胞或组织表面后，必须克服机体局部的防御机制，特别是要干扰或逃避局部的吞噬作用及抗体介导的免疫作用，才能建立感染。,9,(1)不与吞噬细胞接触,不与吞噬细胞接触，如通过外毒素破坏细胞骨架以抑制吞噬细胞的作用，如链球菌溶血素等。,10,(2)抑制吞噬细胞的摄取如荚膜、菌毛和链球菌的M蛋白。(3)在吞噬细胞内生存如结核杆菌和李氏杆菌均可产生溶血素，有助于其从吞噬泡内逸出。,巨噬细胞内的结核杆菌,11,（4）杀死或损伤吞噬细胞,细菌通过分泌外毒素或蛋白酶来破坏吞噬细胞的细胞膜，或诱导细胞凋亡，或直接杀死吞噬细胞。,12,3.在体内增殖,细菌在宿主体内增殖是感染的核心问题，增殖速度对致病性极其重要，如果增殖较快，细菌在感染之初就能克服机体防御机制，易在体内生存。反之，则易被机体清除。,13,4. 在体内扩散,细菌分泌的蛋白酶称为胞外蛋白酶，它们具有多种致病作用，例如激活外毒素、灭活血清中的补体等，有的蛋白酶本身就是外毒素。其最主要的作用就是损伤基质或细胞膜，增加其通透，有利于细菌在体内的扩散性。 透明质酸酶，能分解结缔组织的透明质酸，如葡萄球菌、链球菌等可产生。 胶原酶，主要分解结缔组织中的胶原蛋白，见之于梭菌、气单胞菌等。 神经氨酸酶，主要分解肠黏膜上皮细胞的细胞间质，如霍乱弧菌及志贺菌等可产生。,14,细菌毒素,toxigenesis：细菌产生毒素的能力。细菌性疾病的一种机制。 毒素： 内毒素：革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖。 外毒素：由革兰氏阳性菌及少数革兰氏阴性菌在生长代谢过程中释放至菌体外的蛋白质。,Escherichia coli (Gram - bacteria),Micrococcus luteus(Gram + bacteria),15,一、外毒素（exotoxin）,概念：是病原菌的合成代谢产物，细菌生长过程中产生和分泌到细菌细胞外的毒性蛋白质由G+和部分G-产生并释放到菌体外，化学成分是蛋白质，具有损害易感细胞正常生理功能的毒性作用。,16,（一）来源G+菌（主要来源） G-菌（部分来源） （二）化学成分、结构蛋白质：由细菌产生的非结构蛋白质 1.A-B模式 A亚单位-决定毒性B亚单位-结合活性部分，与靶细胞上受体结合（无毒性）,17,2.单肽链毒素：只1条肽链, 无A、B亚单位区分。葡萄球菌溶血素、链球菌溶血素O、大肠杆菌(O157)溶血素A(HlyA ) 3.小分子多肽毒素：短肽链, 分子量一般5kDa; 一般无免疫原性。 大肠杆菌耐热肠毒素(ST),18,19,A-B toxins,Active,Binding,A,Cell surface,B,21,（三）特点1.毒性强2.选择性强3.不稳定4.抗原性强类毒素、抗毒素,22,1.毒性强,通常只有毒性菌株才能产生毒素，而非毒性菌株不能产生毒素 外毒素是毒力因子的主要决定因素 外毒素的毒性通常非常强：,23,2.选择性强 高度生物活性， 类似酶催化的作用方式 对底物具有高度选择性 作用模式高度专一 只攻击特定的细胞 损伤位点显示毒素作用位点 Enterotoxin （肠毒素）, neurotoxin （神经毒素）, leukocidin (杀白细胞素 ), or hemolysin (溶血素) . 3.不稳定 对热， 酸和蛋白酶敏感,24,4.抗原性强,类毒素 （Toxoids）：由于变性或化学修饰而失去毒性的毒素，但仍保留其抗原性（医学微生物学中将类毒素定义为：将细菌外毒素用0.3%0.4%甲醛处理脱去其毒性，保存其免疫原性即为类毒素） 抗毒素：是一种含有抗体的血清制品。它是把类毒素给马注射，使其产生大量抗体，然后采取马血清，将其精制浓缩而成（治疗作用）。,25,（四）作用机制,26,膜破坏毒素：外毒素通道形成,27,膜破坏毒素：水解磷脂酶，破坏膜的完整性,28,白喉毒素(DT),白喉毒素(DT)的细胞毒作用能够抑制细胞蛋白质合成。能产生毒素的白喉杆菌都是带有温和型tox+噬菌体的溶原菌。若噬菌体由菌体内消失，该菌产毒的能力也消失。DT实际上是溶原菌内噬菌体tox+基因编码产生的噬菌体蛋白质。DT是多肽，DT可被胰蛋白酶降解为A与B两个碎片。A片具毒性酶的活性，可抑蛋白质合成。B片无毒性，易与敏感细胞表面受体结合，是携带A片进入细胞不可缺少的部分。B片C末端是识别特异性受体的主要部位。完整的DT可看成是一种酶原。,29,白喉毒素的作用方式,DT进入敏感细胞:用提纯的A片8nMol/kg给豚鼠注射不显毒性，而用比A片克分子浓度低2000倍的完整毒素(4pMol/kg)却能使豚鼠死亡。这说明没有B片吸附于受体，A片是无法进入细胞的。对B片受体性质了解甚少，可能也是一种神经节苷脂。,30,DT穿过胞膜进入胞浆： （1）DT的结构单位B与细胞膜表面受体结合。 （2）经吞饮入胞，形成吞噬泡进入细胞内。 （3）DT溶解于细胞膜中，疏水的B片携带着A片通过胞膜类脂层，在蛋白酶及一SH作用下，亲水性的A片与B脱离进入原浆，B片仍与膜相连，并继而被蛋白酶分解直至消失。 （4）DT活性单位游离出吞噬泡进入细胞质。 （5）DT的作用于EF2（或称转递酶II)失活，抑制肽-tRNA及mRNA的移位，蛋白质合成被中断。,31,DT抑制蛋白质合成:,在细胞原浆中有两种低分子的可溶性蛋白质，与细胞蛋白质合成有关，称为延长因子1(elongation factor-EF1)及延长因子2(EF2)。过去曾将EF称为转递因子或氨基酰转递酶。EF1是促使氨基酰-tRNA附着于核蛋白体的必需物。EF2是在肽链延长时促使肽-tRNA及mRNA移位的重要成份。DT的作用点就是使EF2失活，抑制肽-tRNA及mRNA的移位，蛋白质合成则被中断。,32,霍乱毒素,霍乱毒素(CT)：由A、B两亚单位组成，A与B亚单位间以非共价键作松弛地联结，易解离。A亚单位又称重链，它又由轻重不等的两条肽链构成，A1肽链，为整个毒素的活性中心，抗原性弱，不被霍乱抗毒素中和，轻者A2肽链，在毒素作用于靶细胞前，有稳定A亚单位复合物的作用。A1和A2由双硫键联结，被巯基化合物还原后，两者即互相脱离，A亚单位通过A2与B亚单位相联。,33,B亚单位又称轻链，单个B亚单位呈球形，整个CT包含有4-6个B亚单位它们以半胱氨酸残基形成分子间桥互相联接，排列成环状，包围在A亚基的周围。B亚单位无毒性，与神经节苷脂（GM1）有极强的亲和力，它的主要功能是与细胞膜受体-GM1结合，把A部分带入细胞。B亚单位的抗原性强，可刺激机体产生IgG、IgA、IgM，这些Ig均能保护机体免受CT的攻击。不含A单位的B多聚体又称霍乱类毒素，为良好的亚单位疫苗，除能供自动免疫外，也可与天然的完整CT竞争膜受体，阻止CT与敏感细胞结合。,34,作用方式,霍乱弧菌侵入小肠后，靠活泼的鞭毛运动穿入肠粘膜上皮细胞。小肠上皮细胞刷状缘的胞膜上有丰富的GM1，CT可与GM1结合而致病。此外霍乱弧菌能分泌唾液酸酶，使肠粘膜上的GD和GT降解为GM1，GM1易被胞膜吸收，融合为膜受体，增加细胞与CT的亲和力。 CT与GM1结合后经过与GM1结合经过25-30分钟潜伏期，可见胞膜上腺苷酸环化酶激活。潜伏期是CT亚单位解离及A亚基进入胞膜所需的时间。激活腺苷酸环化酶主要靠A1，但必需有NAD参加。A1将NAD水解成ADPR及烟酰胺，然后A1与ADPR结合形成A1-ADPR复含物，该复合物能促使腺苷酸环化酶核糖化，腺苷酸环化酶即被激活，导致细胞内cAMP含量增加。进而引起Na+的吸收障碍，Cl-分泌增加，结果电解质和水分在肠腔内大量潴留引起腹泻。,35,（1）CT与胞膜受体结合：CT可与小肠粘膜受体GM1结合，CT在与GM1结合后A与B亚基解离，B亚基通过疏水键使胞膜形成通道，A亚基便可由此进入膜内。 （2）CT与GM1结合后，胞膜上腺苷酸环化酶激活，细胞内cAMP含量增加。 （3）CT激活肠粘膜上皮细胞腺苷酸环化酶，使细胞内亡cAMP增加后，引起Na+的吸收障碍，Cl-分泌增加，结果电解质和水分在肠腔内大量潴留引起腹泻。,36,破伤风毒素受体、作用部位、结果,破伤风杆菌污染了氧化还原势差低的伤口，可在其中繁殖产生破伤风毒素(TT)。TT沿神经轴突向心播散，或经血流运至中枢神经系统，使抑制性突触对运动神经元的抑制解除，引起骨骼肌痉挛，表现为四肢强直，牙关紧闭，角弓反张。神经组织内神经节苷脂成分有GT1、GD1b、GD1a及GM1，并且主要分布在抑制性突触终末的浆膜上，膜上GD1b及GT1即为TT的受体。TT选择性的与神经系统抑制性突触前膜结合，改变膜的性质，阻止抑制性突触释放抑制性神经介质(甘氨酸)，使运动神经元抑制解除，表现为肌肉痉挛。,38,TT中毒后，中枢神经系统无任何形态改变，只有调节功能的障碍。1.脑对肌张力的维持:脑对肌张力有加强和抑制两方面的作用。(1)兴奋作用:脑的兴奋性冲动可直接或间接作用于脊髓灰质前角运动神经元，通过兴奋性突触释放兴奋性介质，作用于a或r神经元。作用于a运动神经元时，引起梭外肌收缩，增加肌张力。作用于r运动神经元时，先引起梭内肌收缩，后引起同一肌的梭外肌纤维收缩。(2)抑制作用:脑下传的抑制性冲动，通过抑制性突触释放抑制性介质，作用于r运动神经元，梭内肌收缩，经r环路使肌张力降低。2.牵张反射:TT与脑及脊髓内抑制性突触前膜结合，阻止了抑制性介质释放，脑干及脊髓内运动神经元的抑制解除，肌兴奋性增高，各种刺激(包括声、光)易引起肌肉强直性收缩。痉挛的肌肉刺激梭内肌的感觉终末，冲动传入，a运动神经元更为兴奋，加重了肌肉痉挛，症状加剧，形成恶性循环。3.破伤风患者呈现四肢僵直及角弓反张的姿势。同时咀嚼肌痉挛，呈现牙关紧闭。,破伤风毒素中毒表现,细胞内作用毒素的进入方式,白喉毒素作用机制,（五）外毒素的应用,1.类毒素：细菌的外毒素经处理后，失去毒性而仍保留其免疫原性，能刺激机体产生保护性免疫的制剂，在类毒素中加入适量的磷酸铝或氢氧化铝，即成吸附精制类毒素。该类制剂在体内吸收较慢，能较长时间刺激机体，使机体产生高滴度抗体，增强免疫效果。 2.抗毒素：对毒素具有中和作用的特异性抗体，能中和某种毒素的抗体或含有这种抗体的血清。应用类毒素进行免疫预防接种，使机体产生相应的抗毒素，可以预防疾病。 3.肿瘤治疗：毒素引起胞内cAMP增加，可抑制瘤细胞的分裂与增殖，有可能用于肿瘤的防治。,42,（1）hIL-13-PE protein能与神经cell、胶质瘤细胞膜受体结合，引起它们的死亡。 （2）mhIL-13-PEprotein能够选择性的与胶质瘤细胞膜受体IL13a2R，使其死亡。,43,（六）外毒素检测,细菌毒素检测通常采用生物学实验，多数情况下用实验动物。 肉毒芽孢杆菌的芽孢:PCR和鼠生物实验 金黄色葡萄球菌：肠毒素动物实验或者反向被动如胶凝剂试验（RPLA），Mini-VIDAS,PCR, Multi PCR, Real-time PCRGB 4789.10-2010 附录B - ELISA 志贺样毒素（SLT）:PCR, Vero细胞毒性试验，ELISA或者RPLA 化脓性链球菌（A型）：PCR (speB),44,内毒素提纲,45,概念,细菌内毒素是革兰阴性菌细胞壁上的一种脂多糖和微量蛋白的复合物,它不是细菌或细菌的代谢产物,而是细菌死亡或解体后才释放出来的一种具有内毒素生物活性的物质。,46,化学成分,由脂多糖（LPS）、蛋白质和磷脂组成的复合物其中LPS包括： 类脂A，核心多糖，特异多糖。,47,LPS结构,48,类脂A,49,结构,内毒素与菌体细胞壁密切相连,其活性成份是LPS,而蛋白质和磷脂与内毒素的活性无关。其中类脂A是LPS活性不可缺少的部分,可视作LPS的“生物活性中心”,是抗原活性部位,保存着LPS的各种生物学活性。,50,细胞壁的结构,51,细胞壁的结构,52,细胞壁的结构,53,G- Cell Wall,54,特殊组分,外膜,55,特点,相对稳定，耐热 有抗原性，但抗体的中和作用较弱。 不能产生类毒素,56,2.内毒素的致病机理,内毒素诱导细胞因子的合成与分泌 过敏性毒素 血小板激活因子(PAF) 细胞因子,57,总说,内毒素所引起的各种生物学效应是通过与靶细胞作用而诱导这些细胞产生一系列炎症介质和细胞因子表现出来的,并非内毒素本身的效应。,58,59,靶细胞,靶细胞包括单核巨噬细胞、B淋巴细胞、粒细胞、血小板、成纤维细胞和内皮细胞等。内毒素诱导产生的炎症介质和细胞因子有C3a、C5a、内啡呔、凝血因子、PAF、TNF、IL-1、IL-6、IL-8、IFN等。,60,2.1内毒素诱导细胞因子的合成与分泌,已经证明动物细胞上有类脂A受体的存在，LPS与靶细胞的结合依赖于靶细胞的LPS结合蛋白(LBP)和CD14。,61,LPS和LBP形成LPS-LBP复合物后,与CD14结合，再与TOR4结合诱导胞膜及胞浆内蛋白磷酸化，然后启动细胞因子基因表达，产生细胞因子。内毒素诱导细胞因子的合成与分泌受细胞因子之间相互作用的影响。,62,CD14,是最早确认的LPS受体。机体内有两种形式的CD14，一种是膜结合形式(mCD14),主要分布于髓样细胞表面,并作为这类细胞的分志,mCD14通过糖基磷脂酚肌醇(GPI)锚定在细胞膜上。,63,另一种是可溶性形式(sCD14),主要存在于血清等体液中,介导非髓样细胞的LPS激活,主要来自髓样细胞表面mCD14的脱落及髓样细胞、肝细胞的合成分泌,可能与肝脏清除内毒素有关。,64,LBP、LPS和CD14的三元复合物,一方面可通过膜上的其他蛋白向胞内传递信号,另一方面也可以内化到胞内,LPS被AOAH酶水解而降低毒性。,65,CD11/CD18,是广泛存在于白细胞表面的一类跨膜糖蛋白,CD11的三种异构体CD11a、CD11b、CD11c分别与CD18结合形成三种同源异质二聚体分子:CD11a/CD18也称白细胞功能相关分子-1(LAF-1)、CD11b/CD18(CR3)和CD11c/CD18(CR4)。,66,CR3能识别补体成分iC3b、ICAM-1、纤维蛋白质、大肠埃希菌和利什曼原虫等多种内外源性物质。这三种整合素异构体均能与未经调理的细菌和LPS结合至单核巨噬细胞、多形核细胞上。虽然CD18缺陷并不影响细胞对LPS的应答反应,但临床研究表明CD18缺陷常会导致反复发作的细菌感染、局部脓疡和伤口愈合困难。,67,TLR,目前发现的TLR成员有十多种,主要分布于一些免疫器官如脾脏和胸腺等,参与LPS信号跨膜传递的TLR主要有TLR2、TLR4和TLR5。,68,69,2.2过敏性毒素,内毒素在激活补体活化过程中产生过敏性毒素C3a、C5a,二者均可使肥大细胞或嗜碱性细胞产生组胺,引起血管扩张,增加毛细血管的通透性,使平滑肌收缩和支气管痉挛等。此外,C5a还可诱导TNF、IL-1等的分泌,参与炎症反应。,70,2.3血小板激活因子(PAF),内毒素可诱导中性粒细胞、嗜碱性细胞、血小板、上皮细胞等分泌PAF。,71,PAF,PAF能引起血小板聚集释放活性物质,使平滑肌收缩和血管通透性增高。血小板聚集,触发凝血系统,引起弥漫性血管内凝血。血小板聚集或参与形成的微血栓栓塞于各脏器,是各脏器功能衰竭的重要原因。,72,2.4细胞因子,内毒素诱导靶细胞产生细胞因子,一方面可激活机体局部和整体的免疫系统参与清除细菌感染;另一方面如果细胞感染严重,大量细菌在血中繁殖,使循环血中堆积大量内毒素,产生大量细胞因子,则可能导致内毒素性休克。,73,通过体内大剂量注射LPS复制的DIC、休克模型,均可检测出高水平的TNF和IL-1;而体内注入TNF和IL-1亦可复制出同样的DIC、休克模型。可证明TNF和IL-1是导致内毒素休克,引起动物死亡的主要效应分子。,74,TNF和IL-1,增强与促进局部和全身炎症过程有关的基因表达以及增强内皮细胞粘附因子的表达。TNF和IL-1作用相似,均为内源性致热原,可导致发热,促进白细胞渗出,破坏血凝抗血凝平衡,抑制抗凝血机制,导致血栓形成等。,75,76,3.内毒素的生物学毒性,(1)内毒素具有致热性,可使人和动物发热,体温升高。 (2)给动物注射内毒素,早期白细胞数量减少,后期白细胞数量明显增加。 (3)内毒素可引起血小板粘附、聚集、触发凝血系统,导致弥漫性血管