南京农业大学生物化学课件6

第 3节 核酸的理化性质一 物理性质 DNA为白色纤维状固体 ; RNA为白色粉末状固体 ? 1、形态2、溶解性微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂； DNA在溶液中粘度大， RNA粘度小。核酸既含有 酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的碱基， 故可发生两性解离。其解离状态随溶液的 pH值而改变。核酸的理化性质3、两性解离由于磷酸基团的酸性很强，所以 pI较低 ，整个分子相当于多元酸。 利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在 260nm处有最大吸收峰。对于纯的 DNA或 RNA，可以通过测得 A260来测定核酸的含量。纯的 DNA： A260/ A280 =1.8 纯的 RNA： A260/ A280 =2.0二 紫外吸收性质 A260/ A280值 可以反映核酸的纯度。核酸的理化性质核酸变性后，在 260nm处的吸收值上升，这叫增色效应 (hyperchromic effect)。 增色效应常可用来衡量 DNA变性的程度。三 核酸的变性核酸在某些物理或化学因素的作用下，其 空间结构 发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活性的降低或丧失叫 变性 。 引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。1.增色效应核酸的理化性质DNA分子变性 ( DNA denaturation ) D.S. DNA S.S. DNA ( 加温 , 极端 pH, 尿素 , 酰胺 ) 变性过程的表现 S.S. DNA粘度降低S.S. DNA 沉降速度加快 S.S. DNA分子的 A 260 nm UV 值上升( Hyperchromicity ) 热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为 DNA的熔点或熔解温度（ Tm） 。2. 熔解温度核酸的理化性质三 核酸的变性热变性曲线 (熔解曲线 )图 5-26 Tm的示意图在 DNA发生热变性的过程中， A260随温度的变化曲线。核酸的理化性质1.1851.01.37ODConcentration 50 g/mL D.S DNA A260 = 1S.S DNA A260 = 1.37dNTPs A260 = 1.60 Tm = OD增加值的中点温度 (一般为 85-95 ) Tm值与 DNA的 均一性 、 G-C含量 、 介质离子强度 、 pH等因素有关。核酸的理化性质三 核酸的变性Marmur-Doty Formula Evaluation GC% of DNA 1x SSCGC% = 30 70% ( 0.15 M Nacl + 0.015 M Sodium Limonate )Tm1 Tm21.01.1851.37ODwhat is meaning ?Tm = 69.3 + 0.41 GC% l 增色效应的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity )高分子量的 DNA分子在热变性过程中 , 富含 AT区域首先发生 变性 , 然后逐步扩展 , 表现增色效应的跳跃现象 , 使变形过程加快 . rich AT rich AT 影响 Tm值的因素 在 A, T, C, G 随机分布的情况下 GC% 含量相同的情况下GC% 愈高 Tm值愈大 GC% 愈低 Tm 值愈小 AT形成变性核心，变性加快， Tm 值小碱基排列对 Tm值具有明显影响 （除变性核心外） 5 CG 3GC n5 GC 3CG n 5 TA 3AT n5 AT 3TA n碱基堆积面 和 碱基积压程度的差异 例：常温下，活体内 D.S DNA分子中富含 AT的变性 核心区（ promoter, terminator region ）常表现氢键的断裂与形成的 “DNA呼吸现象 ”37.6 57 Tm碱基排列对 Tm值具有明显影响大片段 D.S DNA分子之间比较片段长短对 Tm值的影响较小 , 但与组成和排列相关 小于 100bp 的 D.S DNA分子比较片段愈短， 变性愈快， Tm值愈小变性液中含有尿素，酰胺等尿素，酰胺与碱基间形成氢键改变碱基对间的氢键Tm 值 可降至 40 左右 盐浓度的影响 单链 DNA主链的磷酸基团负电荷的静电斥力两条单链 DNA的分离Na+在磷酸基团周围形成的电子云对静电斥力产生屏蔽作用 减弱静电斥力Tm 当 Na+浓度低 屏蔽作用小 斥力加强 Tm TmOD A260 静电斥力 0.01M 0.1M 1.0MNa+当 Na+浓度高 屏蔽作用大 斥力减弱熵值 ( S)上升碱基溶解性降低疏水作用力增加pH 12 酮基 烯醇基pH 2-3 NH2 NH 3+ (质子化 ) 改变氢键的形成与结合力极端 pH条件的影响一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素均将使 Tm 值降低四 核酸的复性1.复性 (renaturation)DNA水溶液加热变性时，双螺旋两条链分开；如果缓慢冷即，两条链可以完全重新结合成各原来一样的双股螺旋过程。复性是变性的逆转。但需要一定的条件，要在一定的盐浓度下缓慢降温。核酸的理化性质DNA 分子的复性 (anneal or renaturation) D.S DNA S.S DNADenaturation Renaturation复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ) 2. 减色效应 (hypochromic effect)当变性的 DNA经复性以重新形成双螺旋结构时，其溶液的 A260值则减小，这种现象称为减色效应。核酸的理化性质四 核酸的复性影响 DNA复性过程的因素 ： 阳离子浓度0.18 0.2M Na+ 可消除 polydNt 间的静电斥力 复性反应的温度 Tm - 25 (60-65 ) 以消除 S.S. DNA 分子内的部分二级结构 S.S, DNA 的初始浓度 C0 DNA 分子中 , dNt 的排列状况 (随机排列 , 重复排列 ) S.S. DNA分子的长度S.S. DNA愈长S.S. DNA愈短 分子扩散愈慢 复性愈慢 分子扩散愈快 复性愈快复性发生的过程讨论遵循 second order kinetics formula （ 二级反应动力学）dCt / dt = -KCt2 两条部分同源的 S.S. DNA, 在复性过程中形成的部分双链区是不稳定的 单链 DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）反应初始 t = 0单链 DNA浓度 = C0反应达 t 时单链 DNA浓度 = CtdCt / dt = -KCt2 积分 Ct / C0 = 1 / 1+KC0t 当 Ct / C0 = 1/2 时Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2)K = 1 / Cot(1/2)Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 不同的 DNA Cot 是不同的， Cot 不但与 K值有关，也与 DNA的复杂性有关； K值取决于阳离子浓度、温度、片断大小及DNA分子复杂性； 如果将其它因子固定，则 K与复杂性 X的关系为：K=1/X, 所以， Cot =1/K =X：Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L) 复杂性 (X)-DNA中没有重复碱基的排列顺序的数值。e.g. (A)n, X =1; (AT)n, X =2; (AGC)n, X =3;(AGCT)n, X =4; (AGCTG)n, X =5; Cot 代表 DNA顺序的复杂程度。Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L)3. 分子杂交 (hybridization)核酸的理化性质四 核酸的复性 不同来源的单链 DNA与单链 DNARNA与 单链 DNA分子间 在长于 20 bp的同源区域内 以氢键连接方式互补配对 形成稳定的双链结构的过程3. 分子杂交 (hybridization)核酸的理化性质四 核酸的复性DNA链在复性时，其中的