基因工程原理第七章

第七章 动物细胞基因操作动物细胞基因操作n 动物细胞基因操作的必须性 :可进行细菌和真菌细胞所无法进行的真正的翻译后修饰n 载体1) 非复制质粒载体2) 带有病毒复制子的质粒3) 病毒转导载体n 细胞：与细胞本身特性、载体、转移、应用相关n 转移：转移技术、瞬时与稳定转染、共转染n 应用：细胞研究、蛋白表达、体内基因治疗、转基因动物第一节 动物细胞 DNA转移技术动物细胞基因转移的途径 =转基因技术n 直接 DNA转移：外源 DNA通过物理转化直接进入细胞如显微注射、含 DNA颗粒轰击、n 转染：化学转染技术、脂质体、电穿孔n 转导：通过动物病毒包裹，利用病毒可以自然感染细胞并将自身核酸分子转入细胞的能力。转染技术n 化学转染技术 (利用胞吞作用 )1) DNA/磷酸钙共沉淀法 适用于单层生长细胞，不适用于悬浮或成团生长的细胞对某些细胞有毒性，难以转染2) 二乙氨乙基葡聚糖 (DEAE-dextran)可溶性聚阳离子制剂，不能用于形成稳定的细胞系n 脂质体 (利用胞吞作用 )低毒性，易操作，效率高，适用细胞类型多，甚至可转染活体细胞n 电穿孔 (利用电脉冲在细胞膜上形成瞬时的纳米大小的孔）转移后 DNA的命运n 具备在宿主细胞内发挥功能的复制起始子，可以稳定复制 (稳定转染 )n 可以整合到基因组 DNA上，稳定复制 (稳定转染 )n 不具备在宿主细胞内发挥功能，也没有整合到基因组 DNA上，瞬时保留 (瞬时转染）n DNA转入细胞的效率远高于 DNA整合的效率n 两个物理上不相连的基因可以发生共转染，甚至可以都整合到基因组 DNA上第二节 动物细胞载体动物细胞载体n 非复制型载体瞬时转染的载体 (启动子功能分析的载体 )选择标记 DNAn 带有病毒复制子的质粒SV40、 BPV、 EBVn 病毒转导载体腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、 Lentivirus等瞬时转染的非复制型载体n 载体无法复制，也不整合于基因组上n 在宿主细胞中往往只能保持 1-2d的稳定n 可以进行基因的表达n 载体上往往具有报告基因，能够报告表达的发生启动子功能分析与报告基因选择标记基因n 未经克隆的含 TK基因的外源 DNA使一些摄入细胞具有了在选择培养基上生存的能力，这样的基因称为选择性标记基因转染实验TK 胸苷激酶核苷酸从头合成和补救途径：编码补救途径的酶的基因 (Hprt,Tk)可以用作选择标记共转化与选择标记n 两个物理上不相连的基因通过共转染，共同整合到基因组中的现象n 这是由于发生了整合之前的 DNA融合n 只要能同时转入一个选择标记基因，共转化现象就可以使任何外源 DNA序列稳定转入哺乳动物细胞n 根据标记基因筛选方法，选择标记可以分为：内源性选择标记、显性选择标记、扩增选择标记内源性选择标记n 来自于动物细胞内的标记基因，大多数涉及与冗余内源核苷酸生物合成途径n 内源性选择标记的缺点：只能用于那些对应基因不具有功能的突变细胞。显性选择标记n 显性选择标记：往往来自于细菌 (外源 )，因此其所提供的表型对于细胞来说是全新的，可用于任何细胞。这些标记通常是细菌的抗药基因，因此阳性细胞可以在适当的药物浓度的培养基上进行筛选。扩增选择标记n 当动物细胞暴露在某种药物的有毒浓度中，少数个别细胞由于自发的、扩增性的抗药突变而存活，这样的 DNA上的扩增性标记，称为扩增选择标记n 出现扩增选择性标记的细胞栽种群中是随机出现的，可进行高浓度抗药性的筛选n 侧翼 DNA序列可随标记基因一起扩增氨基蝶呤DHFR叶酸扩增选择标记n 扩增选择标记也常可用于内源或显性选择标记，但常常用于扩增选择的药物不同扩增选择标记常用于外源基因的高效表达复制子载体：带有病毒复制子的载体n 病毒基因组具有在宿主细胞内独立复制的能力n 可能造成溶解性感染，使宿主细胞裂解，如SV40，由于宿主细胞的裂解，实现的是一种高水平瞬时表达n 可能造成潜伏性感染，从而并不影响宿主细胞生长，实现稳定转染，如 EBV和 PBV，其中 EBV载体相对于 PBV载体复制更加稳定SV40（ 猴多瘤病毒 DNA）病毒转导载体n 外源 DNA分子包入病毒粒子 (通过连接或同源重组的方式插入病毒载体），后者吸附到细胞表面从而进入细胞n 效率很高，而且具有高效复制与高水平表达基因的潜能n 不仅可用于培养细胞，也可用于活体细胞n 腺病毒、杆状病毒、牛痘病毒、 Lentivirus等可复制病毒载体与复制缺陷型病毒载体n 当转移基因插入到基因组中或它所替换的基因对于在宿主细胞中的感染周期不是必需时，载体可以独立的增殖，称为可复制的或不依赖辅助病毒载体。n 当转入基因替换了病毒的必需基因时，这样的载体则称为复制缺陷型或辅助病毒依赖性载体。因为它们失去的功能需要通过共转入携带有载体所缺失基因的辅助病毒来提供。可复制病毒载体与复制缺陷型病毒载体 :以杆状病毒为例无内含载体n 不具有所有病毒编码序列的载体，只含有包装和基因组扩增所必需的顺式作用元件。n 优点 :1) 可容纳高容量的外源 DNA2) 不产生病毒基因产物，对细胞无毒性第三节 细胞与应用正常动物细胞生长特性宿主动物细胞所需特性正常细胞生长特性和宿主细胞所需特性上的差异某种程度上造成了各种