基因的克隆方法

第三章基因的克隆方法1前言前言基因 是生物染色体上的 一段 DNA序列 ，具有转录、翻译成某种蛋白质调控生物生命活动的功能。2基因的表达过程基因的表达过程mRNA翻译成翻译成蛋白质蛋白质基因组基因组DNA3如何获得基因？如何获得基因？ 即基因的克隆方法 基于 基因产物 的基因克隆方法 基于 基因加标签 的基因克隆方法 基于 基因序列 的基因克隆方法 基于 基因图谱 的基因克隆方法4一、一、 基于基因产物的基因克隆方法基于基因产物的基因克隆方法mRNA翻译成翻译成蛋白质蛋白质1、根据 蛋白质序列 克隆目的基因2、根据 基因表达差异（ mRNA） 克隆基因 5原理：根据蛋白质上的一段多肽的氨基酸序列，反推核苷酸序列，然后设计探针或引物从基因组文库或 cDNA文库中分离出相应的基因。1、蛋白质序列克隆法、蛋白质序列克隆法6实用性：分离纯化蛋白质十分困难Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn IleTGTATGGACGAAATGAAAAGAAACATAC T GATG G G T TC据某段氨基酸序列推导可能的核苷酸序列注意！密码子有简并性现象！72、根据基因表达差异（ mRNA）克隆基因基因表达的差异表现：一是基因表达的种类的不同；二是基因表达水平的改变。8 差减杂交（ SH） 抑制性差减杂交 （ SSH） 差异显示 PCR（ DD RT-PCR） DNA代表性差异分析 （ DNA RDA） 扩增限制性片段长度多样性（ AFLP） cDNA微阵列已发展的相应基因克隆方法：已发展的相应基因克隆方法：9 差减杂交（差减杂交（ SH）n最早由 Lamar和 Palmer于 1984年提出并用于雄鼠 Y染色体的 DNA研究。超声波 打断雌鼠的 DNA（ 过量 100倍） (XX)MboI完全消化雄鼠的 DNA (XY)变性、复性去除共有序列BamHI酶切表达载体连接、转化、测序分析缺点：技术要求高，耗时，工作量大NO.1NO.2NO.310SH在 mRNA研究上的应用机理： !不足之处：重复性差，灵敏度低，回收的 cDNA量有限。特异表达基因的样本（ TS）无特异表达基因的无特异表达基因的样本（样本（ RS）提取 mRNA 提取 mRNAcDNA cDNA转录 转录过量杂交TS的 CDNA纯化、富集、扩增去除过量的 RS的 cDNA及杂交分子11 基因突变体的研究：如基因的表达与不表达； 基因时空表达的研究：如根、茎、叶； 不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照。差减杂交技术的应用方面差减杂交技术的应用方面 ：12 1.2.2 抑制性差减杂交（ SSH）Tester样本 mRNA Driver样本 mRNASfiI AcDNA cDNASfiI BA B混合，变性杂交过量A BPCR扩增5 313 应用基因突变体的研究：如基因的表达与不表达基因时空表达的研究：如根、茎、叶不同处理条件下的基因表达差异：如施肥与不施肥、光照与不光照14 1.2.3 差异显示 PCR（ DD RT-PCR） 最先由 Liang等于 1992年报道，目前已广泛在实验室使用。 主要原理：利用真核生物 mRNA结尾处有POLY（ A） 结构，在其 3端设计象 5-T11GA样引物，该引物可 与 mRNA总数的十二分之一结合，从而使这部分基因得到逆转录，同时结合 5端的随机引物（ 20条 10-mer）， 可以使不同长度的基因得到扩增。5 3AAAAAAAAATGCAGC TTTTTTTTTTRPmRNA155 3AAAAAAAAATGCAGC TTTTTTTTTTRPmRNAAATTTTTTTTACTTTTTTTTAGTTTTTTTTTATTTTTTTTTCTTTTTTTTTGTTTTTTTTCATTTTTTTTCCTTTTTTTTCGTTTTTTTTGATTTTTTTTGCTTTTTTTTGGTTTTTTTT 1617具体操作： 1、提取 mRNA； 2、特定引物（ 12分之一）反转录； 3、特定引物和 RP结合 RT-PCR； 4、把不同处理的样品扩增产物按引物组合分别进行电泳比较 DNA带，从而找出差别DNA。18缺点： 假阳性条带多，对低丰度的基因表达不容易检测。 工作量大。 无法定量研究。 扩出的条带往往是 3端比较短的 UTR区的一段序列，提供的信息较少。19优点： 简便、灵敏、高效、省时，能快速显示mRNA的组成。 所需的 mRNA量 少。 各样本 mRNA的差异可同时进行比较。 扩出的 cDNA可直接用于测序、文库筛选等。20二、基于基因加标签的基因克隆二、基于基因加标签的基因克隆方法方法原理：主要是在生物基因组中 插入外源的一段 DNA， 使生物体产生某种突变表型，然后反过来利用这段外源已知的 DNA片段来克隆基因的方法。21外源 DNA基因组染色体 DNA 基因 A产生突变型 分类：T-DNA标签法转座子标签法。22 T-DNA标签法克隆基因技术路线：农杆菌侵染植物得到转化苗，筛选出表现某种突变性状的个体。建立突变体基因组文库及野生型基因组文库 .用 T-DNA片段做 probe筛选突变体文库，获得阳性克隆。用获得的阳性克隆筛选野生型基因组文库，获得野生型的阳性克隆。把阳性克隆转化突变体进行功能互补及进行测序分析。23野生株转基因株目的基因染色体T-DNA染色体T-DNA探针筛选转基因文库作探针筛选野生株基因文库构建基因组文库基因苗构建基因组文库基因苗阳性克隆 目的基因获得阳性克隆基因序列分析，确定为基因阳性克隆转化突变体，确定基因功能 24转座子标签法转座子标签法转座子又称 转座因子或者跳跃因子 ，实际上也是 DNA片段 ，它可以在生物的染色体组中移动，从染色体的一个位点跳到另一个位点，或从一条染色体跳到另一条染色体上，引起基因功能的改变。25转座子标签法u最早是美国玉米育种家 1951年发现，起初不被认同， 1967年在大肠杆菌的半乳糖操纵子中证实后得到认同。u根据 DNA的结构和转座的机理，分为两大家族：转座子和逆转座子，前者如玉米的 Ac/Ds系统和 spm因子，后者如果蝇的 copia因子。26转座子根据结构不同可以分为简单转座子和复杂转座子简单转座子：可以直接插入到其他位置 ,也叫插入序列。复杂转座子：携带有其它基因或遗传标记。结构共同点：两端含有 20-40个核苷酸的倒置重复序列。含有可编码转座酶的基因。应用：以 Ac/Ds系统为例27Ac/Ds系统操作原理把 Ac， Ds分别转化并获得转化体。把 Ac转化体同 Ds转化体进行杂交得到 F1代，然后自交得到 F2、 F3代分离群体，找出稳定突变个体。用 Ds做 probe筛选突变体文库获得突变基因的部分序列。用上述序列筛选正常个体基因组文库或cDNA文库，得到目的基因。28三、三、 基于基因序列的基因克隆基