实验4-琼脂糖凝胶电泳检测dna-2010

实验四 琼脂糖凝胶电泳检测 DNA一、实验目的l 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测 DNA的方法和技术，检测上次实验课提取的质粒 DNA二、实验原理l 带电物质在电场中的趋向运动称为 电泳电泳 。凝胶电泳由于其操作简单、快速、灵敏等优点，已成为蛋白质、核酸研究的首选标准方法l 泳动率泳动率 是带电颗粒在一定的电场强度下，单位时间内在介质中的迁移距离。泳动率与样品分子所带的电荷密度、电场中的电压及电流成正比，与样品的分子大小、介质黏度及电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率，在不同的介质条件下又具有不同的分辨效率l 影响泳动率的因素影响泳动率的因素 包括 样品的物理性状 、 支持物介质 、 电场强度 和 缓冲液离子强度l DNA的凝胶电泳常使用两种支持介质： 琼脂糖凝胶 和 聚丙烯酰胺凝胶关于电泳琼脂糖凝胶电泳l 琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于 琼脂糖的浓度l DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有 电荷效应电荷效应 和 分子筛效应分子筛效应l 在碱性缓冲液中 DNA分子带 负电荷负电荷 ，在外加电场作用下向正极泳动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动l 在一定的电场强度下， DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA分子本身的大小和构型l 琼脂糖凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA，也可以分离相对分子质量相同，但 构型不同构型不同 的 DNA分子l 可以分离长度为 100bp至近至近 60kb的 DNA分子，常采用 TAE、 TBE和TPE三种缓冲体系l 质粒 DNA分子有三种构型 :l CC DNA(共价闭合环状共价闭合环状 DNA:两条核苷酸两条核苷酸链均保持着完整的环形结链均保持着完整的环形结 构，构， DNA呈现超呈现超螺旋螺旋 )、l OC DNA(开环开环 DNA： 质粒的一条链断裂质粒的一条链断裂 )l L DNA (线形线形 DNA： 质粒的两条链均断裂质粒的两条链均断裂 )， 这三种构型的质粒 DNA分子在凝胶电泳中的泳动率不同，因此电泳后呈三条带， CC DNA泳动最快 ，其次是 LDNA， 最慢的是OCDNACC DNALDNAOCDNA电泳方向EB：即溴化乙锭，它能够插入 DNA分子中的碱基对之间而与 DNA结合。由于 EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的 DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测 10ng 的 DNA注意： EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全，必须戴塑料或乳胶手套GoldView :是一种可代替 EB的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测 DNA时， GoldView与核酸结合后能产生很强的绿色荧光信号，其灵敏度与 EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链 DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染 RNA。DNA的染料线性 DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度的关系琼 脂糖凝胶的百分 浓 度 分离 线 性 DNA片段分离的有效范 围 (kb)0.3 60 50.6 20 10.7 10 0.80.9 7 0.51.2 6 0.41.5 4 0.22.0 3 0.1聚丙烯酰胺凝胶电泳l 聚丙烯酰胺凝胶电泳是一种人工合成的凝胶，由 丙烯酰胺丙烯酰胺单体和交联剂 甲叉丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 在催化剂 过硫酸铵 和加速剂TEMED的作用下聚合而成l 可以分离小片段（ 5 500bp） DNA分子l 聚丙烯酰胺凝胶电泳的应用： 蛋白质分子的分离鉴定 蛋白质分子量的测定 核酸的分析核酸的分析 核酸序列测定核酸序列测定在 pH值为 8.0-8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离， 核酸分子带 负电负电 ，在电泳时向正极移动 。采用适当浓度的琼脂糖凝胶介质作为电泳支持物，在 分子筛分子筛 作用下， 使分子大小和构象不同 的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。核酸分子中嵌入 荧光染料 （如 EB）后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。 实验原理三、仪器、材料与试剂l 微波炉l 琼脂糖凝胶电泳系统l 紫外线透射仪l 质粒 DNAl DNA markerl 50TAEl 6凝胶加样缓冲液l 琼脂糖l 1溴化乙锭溶液溶解琼脂糖分离质粒 DNA片段检测质粒 DNA片段电泳样品DNA相对分子质量标准物电泳缓冲液沉降 DNA并起指示作用电泳支持介质嵌入 DNA中，在紫外灯下显色四、实验步骤1. 装好制胶装置 用胶带将洗净、干燥的制胶板两端封好 (一定封严，不能留缝隙 ),使用 水平仪，水平仪， 将胶板调至水平， 插入插入 适当梳子2. 将 1g 琼脂糖加入 100ml 1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液 中，摇匀。在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解（冷却到 60，加入 5l的 1 EB，并摇匀），则为 1 琼脂糖凝胶液3. 将溶解的琼脂糖（约 50 ） 倒入 ，室温冷却凝固4. 充分凝固后 小心垂直向上拔出梳子，小心垂直向上拔出梳子， 撕掉两端的胶布，将凝胶置入电泳槽中 (注意： DNA样品孔应朝向负电极一端 )， 加 1TAE电泳缓冲液电泳缓冲液 至液面覆盖凝胶0.5cm5. 用移液器吸取质粒样品 5l于封口膜上，再加入 1l 的6加样缓冲液加样缓冲液 ，混匀后， 小心加入点样孔 (记录电样的顺序和电样量 )6. 打开电源开关，调节电压至 3 5V/cm，可见溴酚蓝条带由负极向正极移动 (注意 DNA片段从负极向正极移动 )7. 当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿 1 2cm处，停止电泳8. 将凝胶置于紫外线透射仪上，打开紫外灯， DNA存在处显出桔红色荧光条带（ 注意：紫外线对眼睛有伤害作用，应戴上防护眼睛 ）每班 4组，约 30人每组 7人： 1套琼脂糖凝胶电泳系统（电泳槽、电泳仪、制胶板、有机玻璃槽、 8孔梳子）， 20L或 10L移液枪 1支，冰盒 1个， 50mL锥形瓶 1个（贴上 EB标签）。每班配 2台电炉，线手套 2副。实验分组实验分组五、思考题l EB的中文名称是什么？使用 EB时应注意些什么？l 怎么制备一块 20mL体积 1琼脂糖凝胶（含溴化乙锭溶液终浓度 0.5g/mL）？l 什么是 Loading Buffer？ Loading Buffer中含有哪些成分？各组分的作用是什么