实验三+伪狂犬病抗体检测

实验四、伪狂犬病抗体检测（ 阻断 ELISA)酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)将已知的抗原或抗体吸附在固相载体 (聚苯乙烯微量反应板 )表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。 一、实验目的 了解 ELISA的原理和类型 掌握阻断 ELISA操作程序二、实验原理 抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性； 抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性； 酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。 间接法（间接法（ Indirect ELISA） 阻断法（阻断法（ Block ELISA) 双抗体夹心法（双抗体夹心法（ Sandwich ELISA) 竞争法（竞争法（ Competitive ELISA)（ 1）间接法测定抗体）间接法测定抗体A. 将将 抗原抗原 吸附于固相载体表面；吸附于固相载体表面；B. 加抗体加抗体 , 形成抗原形成抗原 -抗体复合物抗体复合物 ; C. 加酶标抗体；加酶标抗体；D. 加底物。测定底物的降解量抗体量。加底物。测定底物的降解量抗体量。显色显色间接 ELISA（ 2）阻断法测定抗体）阻断法测定抗体A. 将将 抗原抗原 吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面 ; B. 先加待检血清（抗体）先加待检血清（抗体） , 形成抗原形成抗原 -抗体复合物抗体复合物; C. 再加酶标单抗；再加酶标单抗；D. 加底物。加底物。单抗血清 ？底物显色阻断 ELISA（ 3）双抗体夹心法测定抗原）双抗体夹心法测定抗原A. 将将 抗体抗体 吸附于固相表面吸附于固相表面 ; B. 加待检抗原，形成抗原加待检抗原，形成抗原 -抗体复合物抗体复合物 ; C. 加酶标抗体加酶标抗体 ; E. 加底物。底物的降解量抗原量。加底物。底物的降解量抗原量。 （ 4）竞争法测定抗原）竞争法测定抗原A. 抗体抗体 吸附在固相载体表面吸附在固相载体表面 ; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体；同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原；对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。抗原量。l酶标板，酶标仪l包被缓冲液： 0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液l猪伪狂犬病毒（ PRV） 抗原l样品稀释液： pH7.4 PBS三、实验材料p阴性对照（ EP管中，已稀释）p阳性对照（ EP管中，已稀释）p样品 待测猪血清（ EP管中，已稀释）pAP标记猪 PRV单抗 酶标单抗（ EP管中，已稀释）p洗涤液：含 0.05% Tween 20的 0.01M pH7.4 PBS（青瓶）常用酶及底物常用酶 底物 反应后颜色辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺（ OPD） 棕黄色碱性磷酸酶（ AP）四甲基联苯胺（ TMB）蓝色n底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液n底物溶液： TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液， 30% H2O2， 新鲜配制n终止液1.抗原处理：2.抗原包被：取酶标板，加入取酶标板，加入 100L/ 孔的抗原稀释液孔的抗原稀释液4 ， 18h取出包被好抗原的酶标板（取出包被好抗原的酶标板（ 4孔孔 /组），甩干孔内液体组），甩干孔内液体以洗涤液（ 200L/ 孔）洗涤 3次， 3min/次四、实验方法3.加待测血清： 标记各孔，加入相应液体 100L/ 孔 1 2 3 4阴性待测阳性待测4.加单抗：37 ， 30min甩干孔内液体以洗涤液（ 200L/ 孔）洗涤 3次， 3min/次各孔加入酶标单抗 100L/ 孔37 ， 30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（ 200L/ 孔）洗涤 3次， 3min/次加入底物溶液 100L/ 孔避光显色， 10min,加终止液 1滴6.观察结果 取稀释好的被检血清 2份和阴、阳性对照血清，每孔加入 100l ，置37 温育 30分钟。 洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液 200l ，静置 3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复 3次。 每孔加酶标单抗 100l ，置 37 温育 30分钟。 洗板：同步骤 2。 显色与终止：每孔先加底物 A液、再 B液各 1滴 (50l) ，混匀，室温（18-25 ）避光显色 10分钟后。 终止：每孔加终止液 1滴 (50l) （ 0.25% 氢氟酸），终止反应。 10分钟内测定结果。采用波长 630nm的酶标仪测定 OD值。 结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均 OD630值与阳性对照孔平均 OD630值之差 0.4。 S=样品孔 OD630值， N=阴性对照孔 OD630值 如果 S/N比值 0.6，样品判定为 PRV抗体阳性 ; 如果 S/N比值 0.7但 0.6，样品可疑 ; 如果 S/N比值 0.7，样品判定为 PRV抗体阴性。五、结果与分析n阴阳性对照样品的 OD630 ?nS/N ?，被检血清是阴 /阳性？n结果与预期的不符，可能的原因是什么？预期结果预期结果l 阳性：无色l 阴性：蓝色1 2 3 4阳性阳性阴性 被检单抗血清 ？底物显色被检？ ？ ELISA前血清样品 37 灭活 30分钟。 在 ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时