实验一细胞形态

n 坎坎坷坷细胞生物学实验生命科学学院实验一 细胞形态、细胞器的显微结构的观察一、实验目的1.了解普通光学显微镜的工作原理，掌握光学显微镜的使用方法。2.熟悉光学显微镜下细胞的基本形态与结构。二、实验原理细胞是生物体的基本结构单位。构成生物机体的细胞是多种多样的。要对细胞进行研究，首先要从其形态结构人手。所以，要借助显微镜的成像及放大原理，在显微镜下，才能观察到细胞的基本形态结构。n 经物镜形成倒立实像，经目镜进一步放大成像。n 显微镜物象是否清楚不仅决定于放大倍数，还与显微镜的 分辨力 有关。n 制作光学镜头所用的玻璃折射率为 1.651.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.050.95；油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近 1.5。n 普通光线的波长为 400700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2m ，人眼的分辨力是 0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为 1000X。 显微镜的分辨率 : 也称为分辨力，它是指能把两个物点辨清的最小距离，分辨距离越大，则分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距离来表示的。其计算公式为 : D=0.61/NA NA=nsina/2式中 D为分辨率， A为光波波长， n=介质折射率； =镜口角（标本对物镜镜口的张角）， NA 为物镜的数值孔径 (镜口率 )。 镜口角总是要小于180，所以 sina/2的最大值必然小于 1。 在物镜上，有镜口率 (N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 物镜 镜口率 (N.A.) 工作距离 (mm) 10 0.25 5.4040 0.65 0.39100 1.30 0.11显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积，公式为 : M = K1xK2焦点深度 : 显微镜调焦到看清标本某一点时，不仅是这一物点，而且它的上下两侧也能看清楚两侧的厚度叫做焦点深度。看到标本的全厚度，必须调节螺旋仔细地从上到下进行观察。厚标本和薄标本厚标本和薄标本4 - 5 um 2um基础知识基础知识三、显微镜概述显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。1.光学显微镜普通生物显微镜由 3部分构成： 照明系统：包括光源和聚光器。 光学放大系统：由物镜和目镜组成，是显微镜的主体。 机械装置：用于固定材料和观察方便，包括镜台 (载物台 ) 、调节器和、物镜转换器 (旋转器 )等。 尼康 E-600显微镜 数码互动显微镜2.体视显微镜n 可直接进行解剖及观察并具有正像立体感3.荧光显微镜 尼康 E800荧光 DIC显微镜 荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色） 荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：n 1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上。n 2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜。n 3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。4. 激光共聚焦扫描显微镜（ 具有高分辨率可进行显微断层扫描）LCSM照片蓝色为细胞核，绿色为微管 （能观察活细胞）5.暗视野显微镜暗视野显微镜（ dark field microscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小至 4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。6.相差显微镜 一种介壳虫的染色体 7. 偏光显微镜 （ 对于双折射物质进行结构研究）偏光显微镜（ polarizing microscope） 用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等。8.微分干涉差显微镜 （图像具有浮雕感）DIC显微镜其优点是能显示结构的三维立体投影影像。与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。 DIC显微镜下的硅藻（伪彩色） 9. 倒置显微镜（ 组织培养中长工作距离的）n 组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上（右图），用于观察培养的活细胞，具有相差物镜。10. 显微操作技术 尼康 NT-88NE显微操作 /注射仪 四、实验用品n 各种组织切片五、 实验步骤(一 )显微镜的使用1. 观察前的准备工作(1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双 眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。(2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。(3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。然后进行合轴调节。学生操作规程及注意事项一、观察前准备检查： 底座右侧的光源亮度旋钮是否在 “ 1” 位置，即顺时针选到最底位。开机： 1.打开后座主电源开关 绿色按钮2.打开后座 CCD电源开关 红色按钮白平衡调整： 不放切片，在 10倍物镜下将电源调整到最亮，然后按底座右方的白平衡按钮（红色） 3 5秒之后将光源亮度调回到适中状态。n 二、观察操作n 放上切片，将光源调到自己习惯的亮度。n 视度补偿 ：调节目镜双筒找到自己的瞳距，此时两眼镜下的图 象重合在一起，横拉板上的数字（例如： 64）就是自己的瞳距，然后将两只目镜外侧的刻度线调到瞳距的数字的位置。n 调焦 ：将绿色光标移至视野中央，开始观察，如需提问，按呼叫按钮。三、下课时的操作1.将光源亮度调到最低 “ 1” 刻度。2.关掉红色 CCD电源开关，再关绿色主电源开关。3.套上显微镜套。4.耳机及凳放整齐。瞳 距 调 节2. 显微镜的调节屈 光 度 调 节调节粗粗 调调 松松 紧紧 调调 节节 旋旋 钮钮聚聚 光光 镜镜