实验三植物不定芽诱导与快繁技术

第四章 器官培养宜职院 08.9目的与要求 了解离体根培养的实践意义，掌握离体根的培养方法，熟悉离体根培养的培养基配方。了解植物茎尖培养的意义，掌握茎尖培养的方法，以及茎尖微繁技术。掌握叶培养概念，离体叶组织培养方法，了解影响叶片组织脱分化和再分化因素。具有植物离体根培养的认知和进行根培养的基础能力，具有熟练进行植物茎尖培养和茎段培养的能力，具有叶培养认知和进行叶培养的基础能力。 一、根培养的实践意义1、是进行根系生理代谢研究的最优良试验体系。2、是研究器官分化、形态建成的良好体系。3、建立快速生长的根无性系，对药物生产有重要意义。4、对根细胞培养物进行诱变处理，可筛选突变体，用于育种实践。第一节 根的培养二、离体根的培养方法1、培养步骤：离体根培养的第一步是要获得无性繁殖系。方法如下：种子表面消毒 无菌条件下萌发 根伸长后切取 1.0cm长的根尖 接种于培养基 侧根生长 切取侧根的根尖扩大培养 获离体根无性系 胡萝卜根培养2、一般方法100ml三角瓶，内装 40-50ml培养液，如长时间培养，可采用大型器皿 500-1000ml培养液的发酵瓶进行培养。根据需要可在瓶中添加新鲜培养液继续培养或分割转移后继代培养。为避免培养过程中培养基成分变化对生长的影响，可采用流动培养方法。 2、根瘤菌结瘤实验的特殊方法Raggio1965年等设计了离体根的结瘤实验装置。此装置由两个部分组成，下部是试管，管中装有含无机盐的营养液，并接种根瘤菌，上部是玻璃盖，盖中有一单向开口的管状凹槽，槽中盛放含有有机化合物的琼脂固体培养基。故有机营养从根基部吸收，无机营养从根尖吸收。 Bunting和Horrocks1964年修改了 Raggio等的装置，变为在粗沙中提供无机盐。利用这一技术研究菜豆、大豆等离体根根瘤菌的固氮情况，结果表明这些根瘤菌含有血红蛋白，并能固定大气中的氮。 Raggio 装置三、离体根培养所用的培养基离体根培养多用无机离子浓度低的 White培养基或其他培养基， MS、 B5等也可采用，但必须将其浓度稀释到 2/3或 1/2。苜蓿离体根的培养液和西红柿离体根的培养液如下：成份 苜蓿浓度 (mg/L) 西红柿浓度 (mg/L) Ca(NO3)2.4H2O 200 143.9Na2SO4 200 100KCl 65 40KNO3 82 NaH2PO4.2H2O 18.6 10.6MgSO4.7H2O 740 368.5MnSO4.4H2O 4.5 3.35FeC6H5O7.3H2O 4. 2.25ZnSO4.7H2O 2.7 1.34H3BO3 1.5 0.75KI 0.8 0.38CuSO4.5H2O 0.004 0.002MoO3 0.02 0.01甘氨酸 3 4 烟酸 0.5 0.75维生素 B1 0.1 0.1维生素 B6 0.1 0.1蔗糖 20000 15000Ph 5.5 5.2 四、影响离体根生长的因素1、基因型 不同植物的根对培养的反应不同，番茄、烟草、马铃薯、小麦可快速生长并继代培养无限生长。萝卜、豌豆需长时间且有限。木本植物很难生长。2、营养条件 硝酸盐是最好氮源，蔗糖是最好碳源，铁、锰、硼、硫、维生素不能缺少。3、激素 生长素对不同植物反应不同4、 pH5、光照和温度 25-27 第二节 茎尖培养一、概念和意义1、茎尖培养概念茎尖分生组织培养：指对不超过 0.1mm的茎尖或几十微米的茎尖进行的培养。特点：可获无病毒苗，操作困难，成苗时间长。普通茎尖培养：对几毫米至几十毫米长的茎尖、芽尖及侧芽的培养。操作技术简单、易成活、成苗时间短、繁殖速度快。 2、茎尖培养意义茎尖培养在园艺植物离体培养中最常见，可快速繁殖无性系、培养无病毒苗、品种改良。 二、茎尖培养一般方法（一）材料的制备健壮枝梢 -去除叶片 -分成 1-2cm-自来水冲洗消毒 -75%的酒精 30秒 -0.1%升汞或 20倍次氯酸钠消毒 8-10min-无菌水 -修剪剥离茎尖，通常切割下顶端0.1-0.1叶原基的茎尖 -（无菌水） -接种。 （二）培养基多为 MS培养基及其改良配方，还有 White配方、B5配方、 Heller配方、 Gautheret配方等。 （三）培养方法1、固体培养法特点：琼脂做凝固剂，茎尖基部紧贴培养基。优点：操作较为简单，普遍。缺点：对有些植物培养较难。操作：培养基分装 灭菌 冷却 茎尖接种 25 +3 培养。2、纸桥培养法滤纸取代琼脂，液体培养基。优点：营养物质能均衡持久地供给外植体，利于外植体健康生长。缺点：操作复杂。 三、普通茎尖培养与繁殖技术茎尖培养可进行植物的无性快繁，并且技术较为成熟，也叫微繁技术。（一）茎尖微繁技术的一般方法1、无菌培养体系的建立外植体制备：正在生长的芽或腋芽、茎段、鳞茎切块、块茎、球茎。茎尖组织大小为带 2-4个叶原基或更多。操作程序：类似一般无菌操作基本技术培养基： MS、 B5、 White等，糖 2-3%，生长调节剂。培养条件： 1000-3000Lx、 16h、 25 。 2、芽的增殖 顶芽和腋芽的发育；利用顶端优势 诱导不定芽产生；外植体直接产生不定芽外植体脱分化 -愈伤组织 -不定芽 原球茎的发育；原球茎 种子发芽时，胚根部不出现，胚逐渐增大，种皮一端破裂，膨大的胚呈圆锥状，称为原球茎。即缩短的、珠粒状的、胚性细胞组成、类似于球茎的器官。芽和种子发育 原球茎 植株 3、中间繁殖体的增殖第二阶段产生的芽、苗和原球茎，统称为中间繁殖体。茎尖的发育方向及调节是采用生长调节剂， BA、KT、 2iP促进发芽， IBA、 NAA、 2， 4-D促生根。4、壮苗和生根胚状体可直接成苗，腋芽和不定芽须转入生根培养基培养。矿质元素高利于茎叶生长，低利于生根，故生根培养基中无机盐低。难生根的植物可以采取： 降低无机盐浓度， 1/2 MS培养基 采用 IBA、 NAA0.1-0.5mg/L 。 添加吸附剂。 减少琼脂。 5、试管苗的移植小根 5cm左右可以炼苗移栽。即将形成的小植株转移到土壤的过程。这个过程是微繁殖最关键的一步。 保持小苗水分供需平衡 选择适当的介质：珍珠岩、蛭石、粗砂、炉灰渣、锯木屑等。 防止杂菌滋生：保持环境干净，农药灭菌。 注意光温管理：避免阳光直射、温度适宜。 （二）影响茎尖微繁因素1、基因型2、外植体大小3、供试植株生理状态4、芽在植株上部位5、供试植株年龄6、培养基7、褐变8、玻璃化9、极性10、后生变化11、中间繁殖体的形态发生能力12、遗传稳定性 茎段 茎尖取材有限，可采用带节或不带牙的茎段进行培养。第三节 叶的培养一、离体叶培养概念及意义1、离体叶培养概念指包括叶原基、叶柄、叶鞘、叶片、子叶等叶组织的无菌培养。多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。2、离体叶培养意义 研究叶形态建成、光合作用、叶绿素形成等理论问题的良好方法。 通过叶片组织的脱分化和再分化培养，以证实叶细胞的全能性。 通过离体叶组织、细胞的培养，探索离体叶组织、细胞培养的条件和影响因素。 利用离体叶组织的再生特性，建立植物体细胞快速无性繁殖系，提高某些不易繁殖植物的繁殖系数。 叶细胞培养物是良好的遗传诱变系统，经过自然变异或者人工诱变处理可筛选出突变体应用于育种实践。 二、叶培养方法（一）叶原基培养：叶原基培养是研究形态建成的重要手段。1、采用休眠期顶芽，剥去一部分鳞片。2、在次氯酸 5%溶液中浸泡 20min，进行表面消毒。3、切取柱状叶原基进行培养。培养基采用 Knops 无机盐（部分修改）或Kundson（ 1951）配方，添加 Nitsch配方中的微量元素（再加 CoCL225mg/L）和 2%蔗糖、 8%琼脂， Ph5.5。部分实验中添加维生素、 NAA、水解酪蛋白等，温度 24 ，人工光照 24h。 （二）叶片组织的脱分化与再分化培养1、叶组织培养的一般方法 叶组织分离与消毒大多数植物的叶原基、幼嫩叶片，双子叶植物的子叶，单子叶植物心叶的叶尖组织，都