实验五植物基因组dna提取

实验五实验五植物总植物总 DNA的提取的提取植物基因组 DNA的提取琼脂糖凝胶电泳检测n 脱氧核糖核酸 (DNA)、核糖核酸 (RNA) n 与蛋白质结合在一起以核蛋白（ DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。n 植物总 DNA包括细胞核 DNA和细胞核外 DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体 DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。核酸的存在形式nDNA为白色类似石棉样的 纤维状物 ， RNA的纯品呈白色粉末或结晶 。核酸和核苷酸大都呈酸味。 nDNA、 RNA和核苷酸都是 极性化合物 ，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。n在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。 核酸的理化性质细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸操作步骤 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法： 用 SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 细胞破碎 uSDS法 SDS是有效的阴离子去垢剂 , 细胞中 DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合 , SDS能够破坏这种价键。uCTAB法 CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的 DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使 DNA与蛋白质分离。DNA提取u 蛋白质 常用苯酚：氯仿：异戊醇（ 25： 24： 1）或氯仿：异戊醇（ 24： 1）抽提。u RNA 常选用 RNase消化 ，或是用 LiCl来消除大分子的 RNA。u 酚类物质 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。u 多糖 提取液中加 1 PVP。DNA纯化（去杂质）实验材料新鲜蔬菜叶片 (去叶脉 )试剂 2CTAB 抽提液TE 缓冲液 (pH=8.0) 氯仿：异戊醇 (24:1)材料与试剂 离心机 水浴锅 研钵 微量移液器仪器用具1取 2g 清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加 1/3 药匙石英砂和 4mL 2 倍的 CTAB 提取液，迅速研磨。2将 1mL 研磨液转入 1.5mL 离心管中，置于 65 水浴中保温 20min，其间颠倒混匀 2 3次。 破碎细胞3. 12000r/min 离心 5min，取上清液 700L转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（ 24:1）混合液，充分颠倒混匀。 12000r/min，离心 5min。 抽提去蛋白4将上清液移入新的 1.5mL离心管内，加 600L异丙醇。颠倒混匀，可见 DNA 絮状沉淀。 沉淀核酸5 12000r/min，离心 1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。 将沉淀回溶于 20L TE 缓冲液待测。操作步骤1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与 CTAB 抽提液充分混匀；2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（ 2 5），尽可能选取幼嫩的材料；3）收集 CTAB 与核酸形成的复合物时不要离心过度，否则沉淀再溶解难；4）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。注意事项DNA分子在高于等电点的 PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下， DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。电泳原理 琼脂糖是一种线性多糖聚合物。 浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。琼脂糖浓度琼脂糖浓度 (%) 线型线型 DNA分子的分离范围分子的分离范围(Kb)0.3 5 600.6 1 200.7 0.8 100.9 0.5 71.2 0.9 61.5 0.2 312.0 0.1 2仪器和试剂仪器 电泳仪 电泳槽 灌胶模具等Tris-硼酸（ TBE）Tris-乙酸（ TAE）Tris-磷酸（ TPE）常用电泳缓冲液 电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖 400组成上样缓冲液。作用： 增加样品比重，以确保 DNA均匀沉入加样孔内。 形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。 使样品呈色，使加样操作更方便。上样缓冲液溴化乙锭（ EB）是一种荧光染料， EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与 DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品 DNA浓度。 琼脂糖凝胶 EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其 DNA量一般 5ng。核酸染色剂注意事项：EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。 DNA分子量标准1.凝胶制备 制备 0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入 20mL 0.5TBE ，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至 50-60 时，加入 EB 至终浓度 0.5g/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。2.加样 取 10l DNA样液与 2l 上样 buffeer 混匀，用微量移液器小心加入样品槽。3.电泳 接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为 15V/cm（长度以两个电极之间的距离计算） ,待溴酚兰移动到一定位置，停止