实验六植物dna提取和分析

实验六 植物组织中 DNA的提取和分析（ P162）一、目的n掌握植物组织中 DNA提取的原理和方法。n掌握 DNA的琼脂糖凝胶电泳检测方法。二、原理n DNA是遗传的物质基础，分离纯化 DNA是研究基因结构与功能的首要前提。n 细胞内 DNA是与蛋白质结合存在的。 在提取 DNA的过程中必须将其中的蛋白质降解除去 同时需要尽可能保证其 DNA分子的完整性n 因此提取时应注意： 在温和的条件下进行提取； 注意避免核酸内切酶引起 DNA的降解； 酸、碱和离子强度等化学因素，以及温度、机械张力、剪切等物理因素可引起 DNA的降解。二、原理植物组织中制备基因组 DNA一般有下列几个策略：n 细胞壁的破碎 通常将植物组织放在研钵中与液氯或干冰一起研磨，形成粉末。n 保持在冰冻状态研磨 以避免 DNA的降解n 细胞膜的破坏 常用去污剂 (如 SDS或 CTAB)。n 保护 DNA免受内源核酸酶的破坏 去污剂的加入及 EDTA的存在都能破坏或抑制酶的活性， EDTA是种螫合剂，它能结合大多数核酸酶的辅因子Mg2+。 用氯仿和苯酚乳化 DNA提取液，使蛋白质变性，分离蛋白质和 DNA。n 尽量 减少 DNA的断裂即使溶液的振荡也会使 DNA断裂n 除去多糖高等植物材料往往含有多糖，而多糖常常是某些限制酶或连接酶的抑制剂氯化铯密度梯度离心法CTAB的核酸提取法也可得到纯的高相对分子质量的DNA，它利用核酸和多糖在 CTAB存在时溶解度不同而分离。二、原理二、原理n 提纯的 DNA为白色纤维状固体利用 DNA易溶于盐溶液，微溶于水，不溶于一般有机溶剂（异丙醇、乙醇）的性质对其进行纯化。n DNA分子在一定 pH值缓冲液中带有电荷利用电泳可对其进行分离和研究。n 从植物幼苗、嫩叶中制备 DNA产率高三、材料、仪器设备及试剂n 材料 小麦幼苗n 仪器设备 高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、紫外灯、低温冰箱、微波炉、凝胶成像系统；三角瓶、烧杯、量筒、微量移液器、研钵、离心管n 试剂 CTAB提取缓冲液 ： 100 mmol L Tris-HCI（ pH值为 8.0）； 20mmol L EDTA； 1.4mol/L氯化钠。 TE缓冲液： 10 mmol L Tris-HCI(pH值为 8.0)； 1 mmoI L EDTA 氯仿：异戊醇（ 24： 1） 异丙醇 70%乙醇 TAE电泳缓冲液： 40 mmol L Tris； 20 mmol L HAC； 1mmol L EDTA 上样缓冲液四、实验方法 n （一）植物组织中 DNA的分离小麦芽 0.1g，装入离心管，冷冻研磨捣碎加入 0.5mLCTAB提取缓冲液65 水浴 10min，其间缓慢颠倒 3次加等体积氯仿：异戊醇，缓慢颠倒混匀，冰浴 5min8000rpm， 10min将上层水相移入另一离心管加 0.7倍体积预冷异丙醇，冰浴 5min8000rpm， 10min弃上清，沉淀用0.5ml70%乙醇悬浮弃上清，风干，加20LTE 溶解沉淀，即得 DNA溶液8000rpm， 10min四、实验方法（二） DNA的电泳分析n 制胶 制备 0.8%的琼脂糖凝胶n 上样 每个点样孔中加 10LDNA 样品和 2L 上样缓冲液n 电泳 以 5V/cm的电场强度电泳 30min，溴酚蓝为示踪染料n 染色 电泳结束