lc ms ms法检测盐酸鲁拉西酮中磺酸酯基因毒杂质

2013Jun;21(3) HPLC法测定枳术颗粒中枳实的 5种黄酮类物质药学与临床研究Pharmaceutical and Clinical Research药 学研 究LC-MS/MS 法检测盐酸鲁拉西酮中磺酸酯基因毒杂质龚心实1，张 斐2，董 静2，刁 旭2，李 薇2，杭太俊1*1中国药科大学 药分教研室 ，南京 210009；2江苏先声药业有限公司 ，南京 210042摘 要 目的 ：采用LC-MS/MS法检查盐酸鲁拉西酮中的痕量磺酸酯基因毒杂质。方法 ：采用 Waters Atlantis T3（2.1 mm50 mm，3 m）色谱柱，10 mmolL-1醋酸铵水溶液（55%）和甲醇（45%）作为流动相，等度洗脱，Agilent 1200 色谱系统和 Agilent 6460 MS/MS（ESI 源）检测磺酸酯。 结果 ：磺酸酯在0.05 ngmL-1至25.00 ngmL-1范围内线性良好，r0.999，加样回收率为85%115%，样品溶液在恒温进样盘（4）中6 h稳定。 结论 ：该方法灵敏度高、准确度良好，可用于盐酸鲁拉西酮中磺酸酯基因毒杂质的定量检测，并为质量控制提供参考。关键词 基因毒；LC-MS/MS；磺酸酯；质量控制中图分类号 R927.1；R991 文献标志码 A 文章编号 1673-7806（2013）03-235-04自从 2007 年甲磺酸奈非那韦事件1以后 ，基因毒物质 （genotoxic impurities，简称 GTIs）成为了欧美新药研发关注的重点之一 。基因毒物质可以与 DNA发生烷基化反应 ，可能引发癌症 ，因此 EMEA（欧洲药品管理局 )以及 FDA（美国食品药物管理局 ）相继颁布了基因毒物质研究相关技术指导原则2-3。Ashby、Bailey 以及 Fettermen 通过 Ames 实验对多种不同结构的化合物进行了安全性评价4-6，PhRMA（美国药品研究与制造商协会 ） 按照毒性特征把基因毒物质划分为五类7。 EMEA 根据药物的疗程 ，对于基因毒物质的暴露量也作了规定2。 近几年 ，国外有较多的文献报道基因毒物质的检测方法 ，如HPLC-UV8、GC9、GC-MS10、HPLC-MS11、HPLC-MS/MS12等 ，国内关于基因毒物质的研究也有所报道13-14。盐酸鲁拉西酮片 （结构式见图 1）是 2010 年被FDA 批准用于治疗成人精神分裂症的药物 ，其作用机制与多巴胺 D2、5-羟色胺 2A、5-HT7 受体的拮抗作用有关 。 盐酸鲁拉西酮合成过程中生成一个磺酸酯化合物的中间体 ， 化学名为二甲磺酸环己烷 -1，2-二甲酯 （SCR3131，结构式见图 2）。 甲磺酸 、苯磺酸在药物合成 、 重结晶及成盐步骤中经常使用 ，而甲醇 、乙醇及异丙醇作为常用溶剂 ，可能生成磺酸酯 ，如甲磺酸甲酯 、乙酯 、异丙酯及苯磺酸甲酯等 ，都被认为是潜在的烷基化试剂 ，已被确定为致癌变的基因毒类物质15。 参照 PhRMA7规定 ，SCR3131 属于第三类基因毒物质 ，对于这类磺酸酯类化合物每天的摄入量不得超过 1.5 gd-1，而盐酸鲁拉西酮的剂量为 0.08 gd-1， 所以 SCR3131 的限度应当为 1.5 g/0.08 g=18.75 ppm19 ppm。尚未见报道该物质的相关检测方法 。本文建立了检测盐酸鲁拉西酮中 SCR3131 的快速灵敏的 HPLC-MS/MS 方法 ， 并用于其质量控制 ，也为其他磺酸酯物质的检测提供参考 。1 材 料1.1 仪器Agilent 1200 高效液相色谱仪 、Agilent 6460 串联质谱仪 （美国 Agilent 公司 ）； 梅特勒电子天平XS205 （瑞士梅特勒 -托利多公司 ）；Milli-Q 超纯水纯化系统 （美国 Millipore 公司 ）。1.2 试药盐酸鲁拉西酮供试品 （纯度 99.5%， 批号 ：作者简介 龚心实，男，硕士生 E-mail: 通讯作者 杭太俊，男，教授 E-mail: tj_收稿日期 2013-01-14 修回日期 2013-02-01*图 1 盐酸鲁拉西酮结构式图 2 SCR3131 中间体产生路线235DOI:10.13664/ki.pcr.2013.03.0292186-45-26、2186-46-26、2186-46-27）、SCR3131对照品 （纯度 99%）均由江苏先声药业有限公司提供 ；甲醇 （色谱纯 ，批号 ：I635007216，德国默克公司 ）；自制纯化水 。2 方法与结果2.1 溶液的配制2.1.1 SCR3131 储备溶液 精密称取 SCR3131 对照品约 10 mg 置于 100 mL 量瓶 ，用甲醇超声使其溶解稀释为 100 gmL-1的溶液 。 取上述溶液 100 L置于 200 mL 量瓶中 ， 用甲醇稀释为每毫升中含有50 ng 的 SCR3131 溶液 ，作为 SCR3131 储备液 。2.1.2 样品溶液 精密称取盐酸鲁拉西酮供试品10 mg，用 5 mL 甲醇溶解后 ，再用水稀释为每毫升中含有 1 mg 的盐酸鲁拉西酮溶液 ，作为样品溶液 。2.2 检测条件的确定2.2.1 色谱条件 色谱柱 ：Waters Atlantis T3（2.1mm50 mm，3 m)；流动相 A 为 10 mmolL-1醋酸铵的水溶液 （55%），流动相 B 为甲醇 （45%），等度洗脱 ；流速 ：0.3 mLmin-1；柱温 ：20；进样体积 ：5 L。为避免污染 ，在分析盐酸鲁拉西酮样品时 ，等度洗脱 5 min 后 ，调节甲醇比例至 90%，旁路流出 ，确保鲁拉西酮主峰不进入质谱分析 ， 其出峰时间为 7.9min，并在 10 min 时调节至初始比例后 ，运行 5 min。再继续下一轮测试 。 供试品样品色谱图见图 3。2.2.2 质谱条件 离子源为 ESI 源 ，正离子模式 ；毛细管电压为 3500 V；干燥气 （氮气 ）温度和流速为350和 7 Lmin-1；鞘气 （氮气 ）温度和流速为 350和 7 Lmin-1；裂解电压 （Fragmentor）为 80 V，碰撞电压 （collision energy）为 25 V。 采用 Multiple Reac-tion Monitoring（MRM）模式采集二级质谱 ，母离子为 318.2，子离子为 256.3。2.3 系统适用性实验在 “2.2.1”项色谱条件下 ，SCR3131 出峰时间为3.2 min。 由图 4 得知空白对 SCR3131 测定无干扰 。2.4 线性关系取 SCR3131 储备液适量用纯水稀释至 25 ngmL-1，摇匀 。 取上述溶液适量 ，用流动相稀释至 12.5ngmL-1，摇匀 。 按照此方法逐级稀释 ，得到系列溶液 。 以浓度为横坐标 ，质谱的峰面积为纵坐标作图 ，绘制标准曲线 ， 其回归方程为 ：Y=3813X+108.4，r=0.9994，在 0.048925ngmL-1范围内呈良好线性关系 。2.5 检测限和定量限SCR3131 的检测限约为 0.02 ngmL-1（信噪比S/N 为 3），定量限为 0.05ngmL-1（信噪比 S/N 为 10）。2.6 进样精密度考察取 SCR3131 储备液 ，连续进样 6 次 ，测定峰面积 ，其 RSD 为 3.0%。2.7 加样回收率实验取供试品 （批号 ：2186-45-26） 约 5 mg 置于 5mL 量 瓶 中 ， 分 别 加 入 100 L、1 mL 和 2 mL 的SCR3131 储备液 ，用流动相稀释 ，SCR3131 浓度分别为 1、10、20ngmL-1。 每个浓度配制 3 份 ，结果见表 1。2.8 重复性试验按照 “2.7”项下 ，配制 6 份 10 ngmL-1溶液 ，进行重复性考察 ，6 份样品的 RSD 为 2.18%，表明该方法重复性良好 。图 3 盐酸鲁拉西酮色谱图 （UV 检测器 ）图 4 色谱图 （质谱检测器 ）（A）空白溶剂；（B）0.1 ngmL-1的SCR3131溶液；（C）盐酸鲁拉西酮中SCR3131（批号：2186-45-26）表 1 SCR3131 的加样回收率加入量（ngmL-1）测得量（ngmL-1）回收率（%）平均值（%）RSD（%）1.00 0.96 96.4499.57 5.561.00 1.06 105.961.00 0.96 96.3110.00 8.99 89.9389.97 0.6110.00 8.94 89.4410.00 9.05 90.5420.00 19.06 95.3191.48 4.0120.00 17.60 87.9920.00 18.22 91.122013Jun;21(3) LC-MS/MS法检测盐酸鲁拉西酮中磺酸酯基因毒杂质药学与临床研究Pharmaceutical and Clinical Research药 学研 究2362.9 稳定性实验2.9.1 储备液稳定性 分别取 100 L、1 mL 和 2mL 储备液置于 5 mL 量瓶中 ， 用流动相稀释为 1、10、20 ngmL-1的 SCR3131 溶液 ，作为低 、中 、高 3个浓度对照品溶液 。于 0、2、4、8、24 h 照上述步骤临用现配 ，分别进样考察 ，每个浓度进样 2 份取平均值 ，与 0 h 比较 ，储备液于室温放置 24 h 稳定 。2.9.2 溶液放置稳定性 将储备液按照 “2.9.1”项下配制低 、中 、高 3 份浓度的溶液 ，放置于恒温进样盘 （4）中 ，于 0、2、4、6 h 进样考察 ，每个浓度进样 2份取平均值 。放置 6 h 后 ，低 、中 、高 3 种浓度相对于0 h 分别为 103.04%、98.11%、104.66%，说明配制后的样品在自动进样器中放置 6 h 稳定 。2.10 样品测定按照 “2.1.2”项下方法配制样品溶液 ，在 “2.2”项色谱条件下进行样品测定 ， 样品批号为 2186-45-26、2186-46-26、2186-46-27，3 批浓度未达到标准曲线的最低点即 0.05 ngmL-1，即未达到 0.05 ppm，属于未检出 ， 说明此批号的盐酸鲁拉西酮样品中SCR3131 含量符合规定标准 。3 讨 论3.1 流动相的确定考察了水 -甲醇 、水 -乙腈 、醋酸铵 -甲醇 、醋酸铵 -乙腈等流动相体系 ，试验结果表明 ，以甲醇作为有机相 ，SCR3131 的质谱响应好于乙腈 ； 使用醋酸铵作为缓冲盐 ，可保证主峰保留时间及 pH 稳定 ，且可以增强离子化效率 。 因此最终选择 10 mmolL-1的醋酸铵水溶液 -甲醇作为流动相 。3.2 色谱柱的确定考察了 Agilent XDB C18、Agilent Aq C18、Wa-ters Sunfire 以及 Waters Atlantis T3 柱 ，试验结果表明 ，样品在 Waters Atlantis T3 上有较好的保留 。 选用粒径为 3m，长度为 50 mm 的色谱柱 ，流速设为0.3 mLmin-1，同时调节有机相的比例至 45%，既可以保证柱效及适宜的保留时间 ，也可以增强质谱离子化效率 ，其保留时间约为 3.2 min。3.3 质谱条件的确定SCR3131 紫外吸收较弱 ，所以选择质谱作为检测器 。 选用单四级杆质谱进行 Selected Ion Moni-toring（SIM）模式检测时 ，溶剂峰易干扰 SCR3131 的测定 ，采用串联质谱的 MRM 模式 ，可提高专属性 。由全扫描结果得知 ，SCR3131 母离子在流动相条件下主要以 M+NH4+和 M+Na+的形式存在 （见图5A）。 由于流动相中含有 NH4+，M+NH4+峰响应较稳定 ，所以选择 SCR3131 的 M+NH4+峰 318.2 作为母离子 。 在 40、60、80、100、120 V 条件下 ，筛选解离电压 ，结果表明 80 V 母离子响应最高 。 确定母离子后将其打碎进行子离子筛选 ， 响应最大的为 256.3，筛选碰撞电压 1030 V， 其最佳电压为 25 V （见图5B），并推测其裂解过程 （见图 6），子离子分子式为C9H18S2O3，M+NH4+为 256.3。 最后进行质谱源参数优化 ，调节毛细管电压 、干燥气温度及流速 、鞘气温度及流速等 ，使灵敏度最大化 ，最终其定量限可以达到 0.0489 ngmL-1。3.4 盐酸鲁拉西酮中 SCR3131 提取溶剂的研究为准确测定盐酸鲁拉西酮中的 SCR3131，所选提取溶剂必须具备以下特性 ：可以使鲁拉西酮充分溶解 ； 可以提取出鲁拉西酮中的 SCR3131；提取溶剂 pH 要合适 ，防止 SCR3131 水解 。 以流动相作为溶剂均可以达到以上要求 。 在提取其他药物中的磺酸酯类物质时 ，应当注意磺酸酯类物质与药物之间反应导致的水解 ，致使检出量偏低 。 尤其是甲磺酸甲酯 、乙酯 、异丙酯此类不稳定的磺酸酯 ，在中性溶液中易水解导致回收率降低 。4 结 论采用 LC-MS/MS 检测盐酸鲁拉西酮中磺酸酯基因毒杂质 ， 检测限达到 0.05 ngmL-1， 即 0.05ppm。 LC-MS/MS 选择性强 ，灵敏度高 ，适用于盐酸鲁拉西酮中磺酸酯的检测 ，有助于质量控制和工艺优化 ， 也可以推广至其他药物中磺酸酯物质的检测 ，如甲磺酸伊马替尼 、洛匹那韦和利托那韦中的磺酸酯检测 。 在检测此类磺酸酯杂质时 ，高浓度的供试品主峰应注意切换不进入质谱仪分析 ，防止离子源污染 。图 5 质谱全扫图（A）SCR3131母离子；（B）SCR3131碎片峰图 6 推测的 SCR3131 裂解路线2013Jun;21(3) LC-MS/MS法检测盐酸鲁拉西酮中磺酸酯基因毒杂质药学与临床研究Pharmaceutical and Clinical Research药 学研 究237参 考文献1 Walker VE, Casciano DA, Tweats DJ. 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