核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用

核酸检测技术及其在国内外血液筛检中的应用输血相关传染病的预防和控制已经成为全社会关注的焦点,新技术的引进是进一步提高血液安全性的重要一环。本文就病原体核酸检测技术(nucleic acid testing, NAT)及其在国内外血液筛检中的应用情况和结果作一介绍,并对该方法在我国推广和应用的必要性和可行性作初步探讨。1. NAT 在血液筛检中的必要性酶免检测(EIA)技术已经广泛运用于血液筛检,该方法的灵敏度和特异性也在不断地改进和提高,但每年仍有少数新发输血后肝炎病例报道,如美国无偿献血者每单位供血传播 HBV、HCV 和 HIV 的危险性分别为 166000、1103000和 1676000 1。这些危险的主要原因是: 病毒感染者“窗口期”献血,病毒变异,免疫静默感染(immuno silent infection)以及人工操作错误 2。所谓“窗口期”,是指从感染病原开始,直至用某种检测方法能够检测到该病原存在为止的这一段时间 3。血清学抗原、抗体检测的“窗口期”较长, 如 HBsAg、抗-HIV、抗-HCV 检测的“窗口期”分别为 45-56、22、72 4,5,故美国 90%以上输血传播 HIV 和 HBV 以及 75%以上输血传播 HCV 的危险性来自“窗口期”感染献血 6。EIA“窗口期”漏检是当前影响血液安全性进一步提高的瓶颈,对于献血者的筛选,单纯抗原或抗体血清学检测不能有效地保障血液安全。 NAT 检测是直接检测病原体核酸的一系列技术的总称。其基本步骤包括核酸提取、扩增、和检测。NAT 敏感性高,可检出标本中极微量的核酸 ,在病毒感染后数天即能检出,可大大缩短“窗口期” 。初步研究表明 ,混合血样 NAT 检测可将 HBV、HCV 和 HIV 感染的平均“窗口期”缩短 9d(缩短 “窗口期”20%)、59d(82%)和 11d(50%)5,7;此外 NAT 还可以检出因上述其它 3 种原因而漏检的被感染献血。如法国应用 NAT,从大约 150 万份献血中筛检出 4 份 HCV RNA 阳性、抗体阴性的样本,其中 1 份即为免疫静默感染 8。尽管 NAT 从理论上并不能完全消除感染“窗口期”,但病毒核酸转阳之前的血液传染性极低 ,可以有效地预防经输血传播病毒性疾病 9。因此,NAT 的引入可使输血传播疾病的危险性降到最低 10。2. NAT 检测的技术方法1985 年具有划时代意义的聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的发明,标志着 NAT 的诞生。随后,在 PCR 的基础上 ,派生出许多其它原理的体外 NAT 方法 11。这些技术灵敏度和特异性或高或低,操作或简单或复杂,适合在各自不同的领域运用，目前适用于大样本量血液筛查并能满足高灵敏度要求的扩证扩增技术主要为 PCR 技术和 TMA 技术。2.1 PCR 扩增方法 PCR 是一种体外模拟自然 DNA 复制过程的核酸扩增技术,以其高敏感性、高特异性和快速简便等优势得到了广泛的应用。通过简单的技术改进和联合,涌现出了各种各样不同的 PCR 方法,如检测 RNA 的逆转录 PCR(RT PCR)、敏感性和特异性均较高的巢式 PCR (nested PCR)、可对靶序列进行定量检测的定量 PCR、检测基因超长分布的多重 PCR 以及 PCR 结合酶标技术(PCR ELISA)、PCR 结合寡核酸探针杂交技术(PCR SSOP)、荧光 PCR 和免疫 PCR 等。目前在临床检测中使用较多的是荧光定量 PCR,主要用于各种传染病的诊断、病毒滴度监测以及疗效评估,因采用荧光标记的探针杂交或直接使用能和双链DNA 结合的荧光素检测 PCR 扩增产物,进一步提高了检测的敏感性和特异性。若加入已知浓度的内标或外标,便能进行定量检测。由于该方法实现了反应体系的全封闭和操作的全自动,不仅减少了污染,还提高了效率。虽然国内许多生物技术企业已经利用荧光 PCR 方法开发出成熟的 NAT 定量检测产品,如深圳匹基、广州达安、上海复星、上海科华、上海浩源等,但这些产品均只获得我国食品和药品监督部门的临床诊断使用许可证。而临床诊断和血液筛检是 2 个不同的应用领域, 血液筛检对试剂的要求要比临床诊断高很多。迄今为止正式通过美国 FDA 认证可用于血液筛检的试剂仅有 2 种,即 Roche COBAS Ampli Screen HBV/HCV/HIV 和 HIV 1/HCV 检测系统 ,FDA 评判这些试剂是否能用于血液筛检的标准之一: 必须对 50copies/ml 的病毒核酸的检出率95%。相当一部分国产荧光定量 PCR 检测试剂或许能在某些标本上获得 20copies/ml的灵敏度,但一般都很难满足 95%检出低病毒载量标本的要求。相信不断提高检测灵敏度,早日研发并注册成功我国自己的 NAT 血液筛检用试剂也是国内生物技术企业的发展目标。2.2 转录介导的扩增方法包括转录介导的扩增系统(transcription mediated amplification,TMA)和核酸序列依赖扩增系统(nucleic acidsequence based amplification, NASBA)。TMA 是一种利用 Money 鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶和 T7 RNA 多聚酶 2 种酶的共同作用,在等温条件下来扩增 RNA 或 DNA 的反应系统,主要扩增原理为: 目标序列在逆转录酶作用下,以引物为引导进行逆转录, 逆转录酶的 RNA酶 H 活性将杂合链上的 RNA 降解以后,合成双链的 DNA,并在 T7 RNA 多聚酶作用下,转录出成千上万个目标 RNA 序列,这些 RNA 又可以作为模板进行下一个循环,整个反应是一个自催化过程。NASBA 的原理与 TMA 相似,只是在核酸提取和扩增产物检测的方法上有所不同。这两种方法的特异性强,灵敏度高,反应条件简单,扩增效率高,无需专门的扩增仪器,且因整个反应在 1 个试管中进行,也减少了污染。2.3 其它 NAT 技术 包括支链 DNA 检测技术(branched DNA signal amplification assay,bDNA)、环介导的等温扩增技术(loop mediated isothermal amplification,LAMP)、连接酶链技术(ligase chain reaction, LCR)和链置换扩增(strand displacement amplification,SDA)等。这些技术或因为自身原因,或因为刚研发出来尚未进入临床,均未在血液筛检中应用。如 bDNA 技术，在 1995 年左右推出,其信号放大是通过碱性磷酸酶(AP)标记的探针杂交结合到一个树枝状核酸枝状体上而实现的。bDNA 技术对待测 DNA 无扩增,特异性较好,能进行病毒定量检测,动态地揭示病毒滴度水平的变化,不仅在预测干扰素疗效方面可为临床提供更为有用的信息,还可作为丙肝病人对干扰素完全应答的标志反应。但也正因为bDNA 技术没有扩增待测核酸,其检测灵敏度远远低于 PCR,故该项技术实际上不适合用于血液筛检,目前国内主要将 bDNA 技术用于 HBV 或 HCV 病毒滴度的定量分析。3. NAT 在国内外血液筛检中的应用3.1 开展 NAT 检测的国家及所用的技术NAT 是一种新兴的检测方法,许多国家及输血机构都进行了一系列的研究,在国外特别是一些发达国家和地区已普遍应用于血液筛检 12，例如,日本是世界上最早在全国范围内对血液进行 HBV、HCV、HIV NAT 筛检的国家 13,新加坡、中国香港也已经分别采用不同的方式对血液进行 NAT 筛检; 德国和荷兰从 1997年起就开始 NAT 筛检的尝试,英国和法国的部分血站也从 2000 年起开始了 NAT血液筛检; 美国则从 1999 年 3 月开始在 FDA 新药审核程序下使用不同的试剂进行常规血液筛检。开展 NAT 检测的国家及其所采用的技术见表 1：表 1. 开展 NAT 检测的国家及所用技术汇总国家或地区 技术 混合检测单检 Germany 德国 (1997 年起部分,1999 年月起，全部） Netherlands 荷兰 (1997 年起） U.K. 英国 (2000 年起） Switzerland 瑞士 Japan 日本(1997 年月起对原料浆；1999 年初起献血者） Canada 加拿大 USA 美国 (1999 年 3 月起） New Zealand 新西兰 Australia 澳大利亚 Singapore 新加坡 Portugal 葡萄牙 France 法国(2000 年起） Spain 西班牙 Italy 意大利 Hong Kong 香港 台湾（2005 年准备中） 韩国（2005 年 1 月起） PCR PCR PCR PCR PCR PCR TMA/PCR TMA TMA TMA TMA TMA / PCR TMA / PCR TMA / PCR TMA TMA / PCR Pool Pool Pool Pool Pool pool pool/IDT IDT pool / IDT IDT IDT Pool / IDT Pool Pool pool Pool Pool TMA/PCR各国采用的技术各不相同（参见表 1） 。日本使用的方法为罗氏公司与日本红十字会共同开发的全自动的 Ampli NAT NPX 系统（为荧光 PCR 技术，可同时联合检测 HBV,HCV 和 HIV） ，目前正在考虑使用 Chiron 公司的 TMA 技术; 美国 ARC 和新加坡使用的是 Chiron 公司的 TMA 技术;美国血液中心(ABC)系统则使用罗氏 COBAS Ampli Screen; 荷兰及部分欧洲国家将荷兰阿克苏公司推出的Nucliesens 全自动核酸提取方法同罗氏的 COBAS Ampli Screen 扩增体系结合起来使用;而英国和法国的部分血站在 2000 年采用的是 Qiagen 的全自动核酸提取系统与罗氏的 COBAS Ampli Screen 扩增体系结合起来的方法, 随后部分血站又更换成 Chiron 的 TMA 技术。各血站根据自身特色, 正在对各种不同的技术组合进行评估, 目的是寻求一种最适合的 NAT 技术 ,既保障血液安全,又能保证血液的及时供给,还要做到省时省力。3.2 国外献血员中 NAT 检测结果从各国公布的 NAT 检出的阳性标本资料总结中可以看出,尽管世界发达国家的血液安全水平已经大幅度提高,但是由于 EIA“窗口期”所致的漏检概率仍然有几百万分之一、几十万分之一甚至几万分之一，具体检测结果见表 2。表 2 国外献血员中 NAT 检测结果汇总国家 试剂 检测方式血清学阴性、NAT 单独阳性检出情况 文献美国 Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay;Roche Cobas AmpliScreen HIV-1 and HCV testsChiron: 16 人份，TMA, 化学发光检测；Roche： 24 人份混合，PCR-ELISA1999.03-2002.03: HCV NAT+： 170/39,721,404，即1/ 23 万；HIV-1 NAT+：12/37,164,054，即1/310 万文献 14 日本 Multiplex HBV/HCV/HIV-1 reagent( Roche 与日本共同研制) 1999 年 7 月 1日-2000 年 1月 31 日，500人份；2002 年 2 月 1日起，50 人份混样;合格血液检测1999.72000.4：HBV NAT+：262560977，即 1/9.8 万；HCV NAT+：92560977,即 1/28.4 万；HIV-1 NAT+：0256.1 万。2000.2.12002.12.31：HBV NAT+：308 16012175，即1/5.2 万；HCV NAT+：46 16012175,即1/34.8 万；HIV-1 NAT+：616012175，即1/266.9 万文献15,16 澳大利亚Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 2 个点单人份，3 个点 16 人份，TMA, 化学发光检测；2000.06.07-2004.11.14：HCV NAT+-：9/4,489,550，即1/49.9 万；HIV-1 NAT+：1/4,489,5504，即1/449.0 万 4,489,550文献 17及个人交流（文献18）中欧 HCV PCR: Roche Cobas Amplicon; HIV PCR: 自己研制的 PCR 96 人份混合 HCV NAT+：6/360 万，1/60 万；HIV NAT+：2/360 万，1/180 万 文献 19 法国 Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV；或 Roche Cobas Ampliscreen HIV-1 and HCV结合 the Organon Nuclisens 核酸提取仪 单检，或 8 人份，或 16 人份,不考虑血清学2001.07-2003.12：HCV NAT+：3/614 万，即 1/205 万；HIV NAT+：2/614 万，即 1/307 万文献 20 新加坡Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 单人份检测 2000.10-2004.10:HCV NAT+： 4304,715,即 1/7.6万；HIV-1 NAT+：0304,715，即0/30.5 万个人交流（文献 21）韩国 Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 16 人份 2004.06.14-2004.12.03，前期评估：单采献浆者 24599，献血者 15597: HCV NAT+：1/40196；HIV NAT 阳性：1/40196；2005.01.01 起，常规检测个人交流（文献 22）南非 Chiron Procleix TMA HIV-1/HCV assay; 单人份 1999 年: HIV NAT+: 2/19709,即 1/1.0 万；HCV NAT: 0/19709文献 23 3.3 我国核酸筛查技术应用研究情况3.3.1 我国核酸筛查技术应用我国有关 NAT 血液筛检研究的报道还比较少见。比较规范的血液筛检研究更少，有的单位利用国产 PCR 试剂加电泳检测的方法进行检测，其实验室交叉污染的问题很难控制。有关我国献血者及原料浆中 NAT 检测工作的情况总结于表 3 和表 4。表 3 国内血液中心开展 NAT 检测研究的情况单位 试剂 检测方式 NAT 阳性 文献深圳保安区中心血站美国Biotronics Tech HBV,HCV AmpliSensor试剂盒20 人份混合15000rpm 离心浓缩，半自动荧光定量 PCR检测HCV NAT+: 1/8805(ALT 390U/L)；HBV NAT+: 抗 -HBc 阳性中：1/946；单项抗-HBc 阳性中：5/495(1)文献 24 厦门血液中心自行设计引物，HCV50 人份混合，NucliSensExtractor 提取核酸，NASBA 技术，混扩增，ECL 检测HCV NAT+: 2/10000,即 15000文献 25江苏省血液中心华美 HCV RNA试剂盒单人份，PCR,电泳 HCV NAT+: 2/750，即1375文献 26 上海血液中心美国 Chiron Procleix HIV-1/HCV8 人份或 24 人份混合；TMA 技术；化学发光检测HCV NAT+: 0103539;HIV NAT+: 0103539;文献 7 北京血液中心匹基HCV/HIV-1 荧光 PCR 核酸检测试剂24 人份混合，26000g离心浓缩，Roche 核酸提取柱，荧光 PCRHCV NAT+: 0/34373;HIV NAT+: 0/34373文献 27多单位参加的国际合作美国 Chiron Procleix HIV/HCV16 人份混合；无菌采血管 EDTA 抗凝，TEAN 自动混样；TMA技术；化学发光检测HCV NAT+：2 /80259(其中 1 个 ALT 254 IU/ml)HIV NAT +：0/80259文献 28深圳血液中心Roche Ampliscreen HBV/HCV/HIV24 人份混合，STAR2000 自动混样;Roche MPLC 自动提取 核酸；Roche COBAS Amplicor 扩增和检测HCV NAT+: 0/16512; HIV NAT+: 0/16512; HBV NAT+: 8/16512,即 1/2064文献 29 及个人交流(深圳血液中心,王良华，2005年月)沈阳血液中心匹基 HCV 荧光 PCR 核酸检测试剂24 人份混合，26000g离心浓缩，Roche 核酸提取柱，荧光 PCRHCV NAT+: 0/8.3 万 个人交流(沈阳血液中心，李剑平博士，2005 年 6 月)中山中心血站及芜湖中心血站厦门长城，无锡三星，上海正业 HCV PCR单人份，PCR,电泳 HCV NAT+: 77/28098(1/365)文献 30表 4 国内原料浆开展 NAT 检测研究情况单位 试剂 检测方式 NAT 阳性 文献中国药品生物制品检定所匹基 HCV/HIV-1 荧光 PCR 核酸检测试剂24 人份混合，26000g 离心浓缩，Roche 核酸提取柱，荧光 PCRHCV NAT+: 0/19196;HIV NAT+: 0/19196文献 31上海莱士血制品有限公司匹基HBV/HCV/HIV-1 荧光 PCR 核酸检测试剂48 人份混合，26000g 离心浓缩，Roche 核酸提取柱，荧光 PCRHBV NAT+: 1/1401718 (1/140 万);HCV NAT+: 31/1401718 ( 1/4.5 万) ;HIV NAT+: 3/1250007 (1/41.7 万)文献 32中国药品生物制品检定所Chiron Procleix HCV/HIV-1 Assay16 人份混合，TMA技术；化学发光检测HCV NAT+ : 1/10032; HIV NAT+: 0/10032个人交流（检定所，白坚石博士，2005 年 1 月）3.3.2 我国核酸筛查技术应用工作小结：1）NAT 检出率：有限的研究数据表明，我国献血者血液 NAT 检出 率HCV NAT+ 检出率结果差异很大， 从 1/365（国产试剂,电泳）1/4.0万0/10.4 不等； HIV NAT+检出率 0/10.4 万； HBV NAT+为 1/946（anti-HBc+ 献血者中 ) 1/2088。我国原料浆 NAT 检出率：HCV NAT+: 1/1.0万1/4.5 万; HIV NAT+： 1/41.7 万；HBV NAT+： 1/140 万（48 人份混合） 。2）必须重视核酸检测的质量控制体系： 注重避免交叉污染： 检测方法：传统的电泳检测为开放式，不适合； 严格的核酸检测实验室设置和管理。 注重试剂质量：为适应血液混样检测对灵敏度的要求，一些国产血筛试剂在临床诊断试剂的基础上已做样品处理的改良，灵敏度（如匹基）在考察期间不错。但仍有待完善，表现在： 灵敏度、重复性、特异性：进口 NAT 血筛试剂质量稳定，各批质量波动小；国产试剂批间差异问题；特异性问题。 内标：进口试剂每个检测管均有内标，保证阴性结果的可靠性；国产试剂由于尚无法解决加入内标后灵敏度降低的问题，未加内标，因此存在假阴性问题。 自动化：进口试剂已有配套的检测系统和软件，便于大规模筛查；国产试剂尚在起步阶段，尚不能实现自动化，没有配套软件。 标本留样和处理：也是核酸检测质量控制体系中的重要环节，否则在检测之前病毒核酸已降解，造成假阴性检测结果。根据我们的研究结果，用于 NAT 检测的标本应用无菌留样管采集。4. 血液核酸筛查发展趋势4.1 NAT 检测先从原料浆开始实施，再在献血者中实施:NAT 血液筛检方法总是从血浆制品的原料浆的筛检开始的,积累了充分的经验后,才逐步应用到血站的采供血系统。例如, 日本从 97 年 11 月起在原料浆中进行 NAT 筛检，1999 年 7 月在东京都试用于献血者中 33 ；欧洲医疗产品规范委员会(CPMP)规定从 1999 年 7 月起所有的血浆制品的原料、中试产品和最终产品都应进行 HCVPCR 检测,当时 NAT 只在少数血站进行评估,而大部分血站供血系统至今仍未进行 NAT 筛检; 美国早在 1994 年 FDA 就曾提出血浆蛋白生产的原料浆必须进行 NAT 筛检,而血站系统则从 1999 年才开始全面进行 NAT 的可行性评估 34。4.2 自动化，集中化检测以地域为单位建立几个大型的集中式的 NAT 血筛中心,既便于质量管理,又能节省检测成本。例如,全日本只设 3 家 NAT 检测中心,分区域对 77 家血液中心的标本进行 HCV、HBV、HIV 核酸检测和分析 35。又如美国红十字会(ARC)在全美成立了 3 个 NAT 检测中心,每天将所有 ARC 血站采集的血液集中到这 3 个检测中心进行 NAT