树突状细胞-转移癌融合疫苗治疗转移性结肠癌研究1

1树突状细胞/结肠转移癌细胞融合疫苗治疗转移性结肠癌的动物实验研究孙新平,丁晓煜 ,赵文鹏,朱宗迅,李渊,张天锋（武警甘肃总队医院医务处 甘肃 兰州 730050）【摘 要】目的：通过建立人免疫重建荷人结肠癌皮下种植瘤严重联合免疫缺陷(SCID)小鼠模型，研究 DC/结肠癌融合疫苗对人转移性结肠癌的发展及预后的影响。方法：应用腹腔注射法对严重联合免疫缺陷 SCID 小鼠注射人外周血淋巴细胞（hu_PBL ）免疫重建后，皮下注射法建立荷人结肠癌皮下种植瘤模型。应用聚乙二醇（PEG) 制备 DC/SW620 融合疫苗。将 DC/SW620 融合疫苗于左、右后足底、尾根部皮下三点注射在人免疫重建的 SCID 小鼠结肠癌皮下移植瘤模型。酶联免疫吸附试验（ELISA）检测小鼠血清中人 IgG 含量；通过直接测量法观察人结肠癌皮下种植瘤成瘤性和小鼠生存期。结果：融合疫苗治疗组的皮下肿瘤体积生长速度慢于其他各对照组；融合疫苗治疗组生存期为（109.0017.17）d，明显长于单纯制模组（55.6712.03， P 0.001） 、免疫重建组（81.839.06， P 0.001） 、肿瘤细胞疫苗组（87.3312.85， P 0.01） 。结论：DC/SW620 融合疫苗可抑制肿瘤生长，改善预后，DC/SW620 融合疫苗比肿瘤细胞冻融物免疫治疗效果更佳。关键词 结肠癌；树突状细胞；细胞融合；严重联合免疫缺陷小鼠中图分类号 R392.12 文献标识码 A 结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，其发病率、死亡率在西方发达国家分别居恶性肿瘤的第 3 位和第 2 位 1-2 。目前除外科手术、化学疗法和放射疗法外，免疫治疗作为辅助治疗新途径，日益受到研究者的关注。它治疗的靶点和毒性作用与传统治疗措施没有重叠,靶向性好，产生的记忆性免疫效应细胞可预防肿瘤复发。其中树突状细胞/肿瘤细胞融合疫苗在针对多种恶性肿瘤的研究中取得了抗肿瘤作用 2、3-5 。本研究拟通过建立人免疫重建荷人结肠癌皮下种植瘤SCID 小鼠模型，研究 DC/结肠转移癌融合疫苗对人结肠癌发展以及预后的影响。1 材料和方法1 作者简介： 孙新平（1962） ，男（汉） ，甘肃秦安，主任医师，硕士，胸心外科专业。2 联系地址： 兰州市龚家湾建兰新村 251 号武警医院医务处，电话 E-mail:1.1 材料 SCID 小鼠：无免疫渗漏 ( IgG 1g/ ml)的 C.B17/SCID 纯系小鼠，雄性，46 周龄， 30 只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于无特殊病原体（SPF ）环境（北京大学医学部动物实验中心） ，饲料、饮水、垫料等均经无菌消毒。人结肠转移癌细胞株 SW620 由上海细胞所购入。健康人浓缩白细胞，购自北京市红十字会中心血站。50%聚乙二醇（PEG ）购自 Sigma 公司（美国） 。人 IgG ELISA 试剂盒购自 Pierce 公司（美国） 。其他试剂为市售高级试剂。1.2 方法 1.2.1 人外周血淋巴细胞（hu-PBL）及 DC 的分离培养：用淋巴细胞分层液密度梯度离心法从健康人浓缩白细胞中分离出人外周血单个核细胞，以含 5%人血清的 RPMI1640 培养，24h 后吸取未贴壁细胞（主要为淋巴细胞） ，用RPMI1640+5%人血清培养，并加入 20U/ml IL-2 培养 24 小时后用以对 SCID 小鼠的免疫重建；贴壁的细胞则继续用 RPMI1640+5%人血清培养，并加入1000U/ml rhGM-CSF 和 1000U/ml IL-4，培养第 6 天加入 TNF-800U/ml 使树突状细胞成熟。1.2.2 DC/SW620 融合疫苗的制备：结肠转移癌细胞株 SW620 以含 5%胎牛血清的 RPMI1640 培养，常规换液传代。DC 与 SW620 细胞按 1:3 的比例混合，室温下用 PEG 融合法融合。1.1.3 免疫重建荷人结肠癌皮下移植瘤模型建立及治疗：（1）实验分组：将 30只 SCID 小鼠随机分为 A 假手术组、B 单纯制模组、C 免疫重建组、D 融合疫苗治疗组、E 肿瘤细胞疫苗组五组，每组 6 只。 （2 ）腹腔注射法免疫重建：在第 1 周，C 、D、E 组腹腔注射 300 L 含 3107hu_PBL 的 PBS，A 、B 组腹腔注射等量不含 hu_PBL 的 PBS。 （3）皮下注射法建立结肠癌皮下种植瘤模型：第2 周，B 、C 、 D、E 组小鼠于右腋下注射 150 L 含 5106SW620 细胞的PBS， A 组小鼠注射不含 SW620 细胞的等量 PBS。 （4）皮下注射法免疫治疗：DC/SW620 融合疫苗和 SW620 细胞冻融物在注射前经过 Co-60 射线 30 GY 剂量照射，以杀灭其中残留的肿瘤细胞。第 3 周，D 组在左、右后足底、尾根部注射含 1107DC/SW620 融合疫苗的 PBS 每部位 50 L，E 组于相同部位注射含 1107SW620 细胞冻融物的 PBS 每部位 50 L 第 4 周、第 5 周 D、E 组重复上述治疗，共 3 次。1.2.4 皮下移植瘤模型的疗效评估： B、C、D、E 组制模后每周测量小鼠皮下瘤的最长径 dmax 和最短径 dmin，体积 V=0.52dmin2 dmax 6。记录各组小鼠的生存期。1.2.5免疫重建效果的测定 每组每只小鼠在第5周 7时剪尾取血20 L/只，分离血清，用ELISA方法检测人IgG含量。1.2.6 统计学处理 利用 SPSS10 For Windows 软件进行单因素方差分析。当P0.05 认为有统计学意义。2 结果2.1 用腹腔注射法成功建立模拟人类免疫功能的模型 应用 ELISA 方法在免疫重建后第 5 周的小鼠血清中检测到了人 IgG，C 组、D 组、E 组阳性均为 6/6。但各组之间 IgG 水平无显著性差异（表 1） 。表 1 SCID 小鼠血清中人 IgG 表达情况（ ELISA 法）分组 n 人 IgG 水平 g/mlA(假手术组) 0/6 0B(单纯制模组) 0/6 0C(免疫重建组) 6/6 335.9158.66D(融合疫苗治疗组) 6/6 326.2748.23E(肿瘤细胞疫苗组) 6/6 337.0786.422.2 DC/SW620 细胞融合瘤疫苗可抑制皮下肿瘤的生长，明显延长治疗组的生存期。2.2.1 每只建模小鼠都长出了皮下瘤（图 1） 。图 1 DC/SW620 融合疫苗对结肠癌皮下种植瘤的影响。 （A 假手术组 B 单纯制模组； C 免疫重建组； D 融合疫苗治疗组； E 肿瘤细胞疫苗组）2.2.2 DC/SW620 融合疫苗治疗组曲线低平，提示与其他 3 组相比，此组小鼠皮下瘤生长受到抑制。 （图 2）图 2 DC/SW620 融合疫苗对结肠癌皮下种植瘤生长的影响。 （B 单纯制模组； C 免疫重建组；D 融合疫苗治疗组； E 肿瘤细胞疫苗组）2.2.3 DC/SW620 融合疫苗可明显延长荷人结肠癌皮下种植瘤小鼠生存。融合疫苗治疗组生存期为 109.0017.17 天，明显长于单纯制模组（55.6712.03， P=0.000） 、免疫重建组（81.839.06， P=0.002） 、肿瘤细胞疫苗组（87.3312.85， P=0.010） 。 （表 2，图 3）表 2 DC/SW620 融合疫苗对结肠癌皮下种植瘤模型生存的影响分组 n 生存期（天） P 值B(单纯制模组) 6 55.6712.03C(免疫重建组) 6 81.839.06D(融合疫苗治疗组) 6 109.0017.17P1=0.000*P2=0.002*P3=0.010*E(肿瘤细胞疫苗组) 6 87.3312.85 0.000#*与 B 组比较 *与 C 组比较 *与 E 组比较 #与 B 组比较图 3 DC/SW620 融合疫苗对结肠癌皮下种植瘤模型生存的影响。 （A 假手术组；B 单纯建模组； C 免疫重建组； D 融合疫苗治疗组； E 肿瘤细胞疫苗组）3 讨论DC/结肠癌融合疫苗能有效抑制结肠癌的发生发展。本研究室前期研究成功构建了异源 DC 与结肠癌细胞的融合并且成功诱导出 CD4 T 细胞和 CD8 T 反应，CTL 对结肠癌靶细胞的杀伤效力高于传统的 LAK 细胞疫苗和 TIL 细胞疫苗，融合疫苗可以诱导结肠癌细胞凋亡 5,8-9 。本研究利用 DC/SW620 融合疫苗治疗结肠癌皮下移植瘤模型，取得了较理想的效果， DC/结肠癌细胞融合疫苗可发挥抑制肿瘤生长，改善预后的治疗效果。将肿瘤细胞和 DC 融合，能充分发挥DC 作为抗原提呈细胞的作用，有效地激活抗肿瘤免疫应答。通过融合过程，产生的融合细胞能在 DC 介导的共刺激作用下将广谱的肿瘤相关抗原提呈给 T 细胞。尤为重要的是，肿瘤细胞的抗原可以作为融合细胞产生的内源性肽通过 MHC I类途径提呈，同时也可以与 MHC 类分子结合而诱导出 CD4 T 细胞免疫反应。其他抗原负载 DC 的方式多是单一的激活 MHC I 类或 类分子介导的免疫反应，融合细胞独具同时激活 CD4 T 细胞和 CD8 T 细胞的能力。由此产生的细胞毒性反应与辅助性 T 细胞反应的协调作用，对于抗肿瘤免疫的有效性和可持续性至关重要 10。DC/结肠癌融合疫苗比结肠癌细胞冻融物有更强的抗结肠癌细胞作用。本研究比较了 DC/结肠癌融合疫苗和结肠癌细胞冻融物的治疗效果。结果发现，虽然结肠癌细胞冻融物对结肠癌也能起到一定的抑制作用，但效果都不如 DC/肿瘤融合疫苗更理想。肿瘤细胞冻融物不具备 DC 的抗原提呈功能，不能持续提供抗原，特异性差。DC/肿瘤细胞融合疫苗具有肿瘤细胞冻融物不具备的优势：融合疫苗能自然加工抗原性肿瘤蛋白，并以 MHC-I 类复合体的形式提呈到细胞表面；融合疫苗能促进 DC 的功能，能为 MHC-I 类复合体的提呈提供连续的内源性肿瘤抗原 11-12。近年来，应用 DC/肿瘤细胞融合疫苗治疗恶性肿瘤，被广泛研究并部分应用于临床治疗，取得了一些成绩，但同时也发现了一些问题：目前通用的体外诱导和培养 DC 的方法耗时、费力、价格昂贵，不能规模化生产，且易被污染，尚不能广泛应用于临床。相信随研究的深入，DC/结肠癌细胞融合疫苗有望成为治疗结肠癌的新有效途径。参考文献1 Feng Xu,Ying-JY, Wei Liu, et al. against colorectal cancer liver metastasis in SCID miceJ.Scandinavian Journal of Gastroenterology June, 2010, 45(6): 707-713. 2Ahmedin J, Rebecca S, Elizabeth W, et al. 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