淘汰血红蛋白血液硫酸铜比重试验

淘汰血红蛋白血液硫酸铜比重试验、沙利氏目测法的原因及替代方法血红蛋白(Hb)是红细胞的主要成份，具有与氧分子呈可逆性结合的功能，是人体内氧的运输和交换的主要载体。许多疾病的病理生理变化都涉及 Hb 质或量的改变。因此，选择一种简便、快速、准确的 Hb测定法，对于贫血及其他造血系统疾病的诊断和治疗有着重要的意义。自 1875 年 Gower 设计稀释溶血液目视比色法以来，血液学工作者对 Hb 测定进行的大量探讨，大致可分为四大类，即：（1）根据血液物理特性测 Hb(比重法) ：(2)根据 Hb 分子组成而设计的总 Hb 测定法(全血铁法) ；(3)根据 Hb 有 O2 可逆性结合的特性测 Hb(血气分析法)，和(4) 根据 Hb 衍生物光谱特点进行的定量法。其中有些方法虽简单易行，但误差较大，随着技术的进步和研究的深入，逐渐被淘汰。惟其如此，此次卫生部令决定在国内淘汰硫酸铜比重血红蛋白测定法和沙利氏(Sahli)比色 Hb 测定法，并推荐氰化高铁法做为可替代的方法。淘 汰 的 理 由 一、为什么淘汰血红蛋白硫酸铜比重测定法 硫酸铜比重法测量血红蛋白的实验原理是根据血液血红蛋白与比重的关系，将血液滴入己知比重的标准硫酸铜溶液内，观察血滴悬浮的情况，求出血红蛋白含量的近似值。不难看出，此法相当粗糙，很难得出精确的结果。其干扰因素很多，有自然因素，也有人为因素。例如：(1)硫酸铜含 5 个结晶水，易于风化和潮解，不易准确配成各种比重的溶液。(2)多次加入血液后，硫酸铜溶液的比重有所改变，影响沉淀的准确度。(3)滴入的血样包括血浆和有形成份(血细胞) 两部分，血浆成份( 如血脂、血浆蛋白)质和量的改变或血细胞病理性变化(红细胞的大小及其内在的 Hb 含量) 均与比重有关。因此，单从全血比重角度推测Hb 含量，有时会带来偏差。(4)需要严格掌握实验条件。不但要注意溶液配制时的温度，试验时标本与硫酸铜溶液温度也必须十分接近。有报告指出，在室温(22) 的硫酸铜溶液不宜与刚从人体采出的血液 (37)试验，这点在冬季尤为重要。另外，实验时也需严格的操作步骤(如加血样手法、高度、观察血滴动态变化情况)，这些条件直接影响实验的准确程度。由于这些不足，卫生部令废除此项实验。二、为什么淘汰血红蛋白沙利氏比色测定法1895 年沙利氏刨用了酸化血红素法进行 Hb 的比色测定，在全世界应甩昂近百年，长期以来此法在临床检验中(特别是在基层医疗单位 )起了很大作用。但随着技术的进步和研究工作的深入，其缺点亦日渐突出，现已不能满足日益发展的临床医学的需要。其主要缺点为：(1)不能转化生理或病理血液中全部的Hb，对碳氧血红蛋白，还原型血红蛋白转化很慢或转化不完全。(2)由于目视比色，个体观察的主观差异较大。(3)血红蛋白转化时间较长，5 分钟转化 88，10 分钟 95， 2 小时才基本转化完毕。(4) 纶戋反应不明显，在接近或到达终点时，加入稀释液后颜色变化不明显。比色过程不易标准化，往往由于比色板颜色不一致而影响测定结果。(5)色板与转化液色调不一致，往往给实验带来误差。由于这些因素，此次部长令决定淘汰沙利氏 Hb 测定法。替 代 方 法 一、氰化高铁血红蛋白(HiCN)测定法及其质量控制 为统一 Hb 测定方法，1966 年国际血液学标准化委员会(1CSH)推荐氰化高铁血红蛋测定法( 下称 HiCN)作为国际 Hb 测定标准方法。1978 年 ICSH，国际临床化学联合会(1FCC)和世界病理学会联合会(WASP)发表2的国际性文件中重申了 HiCN 法。1983 年中华医学会临床检验分会桂林会议以来，HiCN 法逐渐在国内普及，对 Hb 测定的标准化起了重要作用。下面着重介绍 HiCN 法及其有关问题。（一）HiCN 法的优点HiCN 法之所以被选为国际标准方法，是因其具备以下几个重要特点：(1)操作简单，稀释液(试剂) 为单一试剂。(2)除 SHb 外，其余 Hb 衍生物均可很快地转为 HiCN。(3)HiCN 在 540nm 处吸收峰较宽，可用一般分光光度计或滤光板比色计进行测定。(4)显色快而稳定，因此 HiCN 液可制成在相当长时间(至少六年)内稳定性不变的标准液，这对进行质量控制工作极为有利。(5)可以通过分光光度法测定直接定值。（二）实验原理血红蛋白被高铁氰化钾氧化成高铁血红蛋白(Hi)，后者与氰基结合成稳定的棕色氰化高铁血红蛋白(HiCN)。在规定的波长和液层厚度的条件下具有一定的吸光系数。因此，根据其吸光度，即可求得 Hb 浓度。其化学反应式为HbK 3Fe(CN)6HiHiCN-HiCN(三) 试剂经典的 HiCN 法有二种常用试剂(又称为转化液) ，其配方为：Drabkin(都氏)液：称取 K3Fe(CN)6)200mg，KCN 50mg 和 NaHCO31g，加蒸馏水至 1000ml。Van KampenZijlstra(文齐氏)液：K 3Fe(CN)6)200mg，KCN：50mg，KH 2PO4l40mg，TritionX100 0.5 至 lml，加蒸馏水至 1000ml。从以上配方可以看出，两种试剂基本成份一致，唯 pH 不同。都氏液含有 NaHCO3，pH 值 8.5，远离病理性血清蛋白(大多属于优球蛋白 )的等电点。因此，检查这些病人时不易产生混浊，但反应时间过长 (多数 40 分钟)为其不足。相反，文齐氏液因其 pH 值(7.2 士 0.2)较低，反应较快，5 分钟后即可比色，但因该液的 pH 值接近于病理性血清蛋白等电点，易产生混浊。目前国内外常用文齐氏液做为常规使用。(四) 操作方法1取指血 20l，加到 5ml 血红蛋白转化液中，混匀，静置 5 分钟。2用分光光度计(或 581G 光电比色计 )测定。波长 540nm(或 581G 绿色滤光板)，光径 1cm，以蒸馏水或空白转化液调零，测定吸光度“A”。3如果使用符合 WHO 标准的分光光度计，则可根据测定吸光度“A”直接计算出血红蛋白浓度：3其中 A540HicN 为测定管吸光度。64458 为 Hb 分子量。644581000 为 lmmolLHb 溶液中含 Hb 克数。251 为血液稀释倍数。(五) 有关 NiCN 测定应注意的问题1仪器问题HiCN 法优点之一，就是通过分光光度法可直接定值，即 Hb(gL)AX 367.7。但使用 367.7，这个常数是有条件的，即所测吸光度的分光度计波长必须十分准确，540nm 处单色光纯度高，吸收池光程为准确的 lcm，稀释倍数为 1：251，且测定结果的灵敏度高，线性好。因此，仪器的校正是测定中的关键，决定着测定结果的正确与否。校正分光光度计的方法很多。对于 HiCN 测定最有效、最简单的校正方法是用特殊的 HiCN 标准校正液，因为这种溶液有特殊的吸收光谱并可保持 6 年不变。因此，用同批号的标准液即可根据其光谱特性去校准仪器，又可用其稳定性来监测已校准的仪器。校正大致有以下几个步骤；(1)波长：因为标准液吸收峰为 540nm，波谷为 504nm，故可将校正液放在待测光度计中，从 500 至 580nm 分几个波段测量其吸光度值。如果所得吸光度值的最大吸收峰在 540nm，证明仪器波长准确，否则调试仪器有关部分。但在实际工作中对波长偏差不太大的仪器，可采用“将错就错”的办法，即如用 HiCN 标，准液所得吸收光谱的最好吸收峰是 535nm，说明该仪器的 535nm，实际上是 540nm，实际工作中即可用 535nm进行测定。(2)灵敏度：在实际工作中，特别是基层单位，在无符合标准的分光光度计时，溅得的吸光度(A)往往偏低或偏高。因此不能直接按前文介绍的方法进行计算。但可用 HiCN 参考液，照一般生化法绘制标准工作曲线或按以下方法求出 K 值后计算。例如，用定值为 50gL、100gL、150gL 和 200gL 的 HiCN 参考液，在721 型分光光度计上测得吸光度 A 分别为 0.13、0.27、0.405、0.54，则可按下式求出吸光度血红蛋白换算常数(K)然后根据测定管吸光度“A”，即可用 AXK 算出血红蛋白浓度。为方便起见，还可根据 K 值列出吸光度“A”和 Hb(gL)对照表。(3)杂光；从单色器到达检验器的除检测所要求的单色光以外，其他波长的光称为杂光。杂光水平通常以其贡献的能量与总能量之比的百分数表示。ICSH 推荐的 HiCN 测定法中，规定吸收曲线中波峰 (540nm)和波谷(504nm)吸光度之比为 Q 值，并可由 Q 值制定 HiCN 标准校正液的纯度。在分光光度计已严格校正且无杂光存在的情况下，若测得，Q 之值为 159 一 1.63，表明该 HiCN 标准校正液的纯度合格。但对纯度合格的 HiCN 标准校正液，杂光的存在可使其吸收光谱的 Q 值降低(杂光主要使波峰 540nm 的吸光度下降，而4对波谷 504nm 的吸光度影响不大),故可根据纯度合格的 HiCN 标准校正液的 Q 值，了解仪器的杂光程度(表 1)。表 1 纯度合格的 HiCN 标准校正液在不同杂光水平的 Q 值 杂光水平（%） 15 19 6 125 20Q 值 16 159 155 17 138(4)线性：在仪器性能测定时，常用一种在一定波长范围内，确知其服从 Beer 定律的有色物质配成不同浓度来检查仪器本身是否能如实反映浓度变化，这就是仪器的线性检查。Hb 测定用的分光光度计线性也可用HiCN 标准校正液来检查。方法是将已知浓度的 HiCN 液准确稀释成各种浓度，分别测定。然后以稀释液浓度为横坐标，吸光度为纵坐标作图，各点连线应为直线。如有个别点不在直线上，作图时应使直线通过尽量多的点，将不在直线上的点吸光度与所代表的浓度在直线上的吸光度、比较。一般规定 Hb 浓度100mg/L 以上的点，两者之差不得超过 2(100mgL 以下的点，可适当放宽)。(5)吸收池：吸收池的厚度及透光性是影响实验的又因素。厚度可用卡尺鉴定，若不是 lcm，则测定结果应乘校正系数。透光度可用下述方举测定：溶解 02mg 伊文氏兰于 100ml 蒸馏水中，放入所有待测吸收池内，用一吸收池做标准，将仪器读数准确调到 50T(透光度。) ，将其它吸收池逐一与标准池比较，透光度在50T 士 0.5内者为合格。读数时应反复交替测定标准池与待测池的透光度，尽量减少仪器漂移的影响。标记吸收池的透光面，以便在以后应用中，使同一侧面向光源。(6)血红蛋白吸管和稀释器的校正：血红蛋白吸管，稀释器吸量准确与否直接影响 1：251 倍稀释度的准确性，也是产生实验系统误差的重要因素之一，定期校正，十分重要。血红蛋白吸管的校正，通常采用水银称重法。将待校正吸管先用清洁液，蒸馏水，酒精乙醚清洁干燥，然后准确吸取 AR 级水银至刻度，在注入已称量的称量瓶中，在分析天平上称出水银重量，根据称量时的温度下水银的密度（表）即可求出水银的试剂容量表 水银密度与温度的关系（mg/l）温度位数 温度个位数 0 10 20 300 13.5951 13.5704 13.5457 13.52121 13.5926 13.5679 13.5433 13.51872 13.5901 13.5654 13.5408 13.51633 13.5871 13.5630 13.5384 13.51384 13.5852 13.5605 13.5359 13.51145 135827 13.5580 13.5335 13.50916 13.5802 13.5556 13.5310 13.506557 13.5778 13.5531 13.5286 13.50418 13.5753 13.5407 13.5261 13.50619 13.5723 13.5482 13.5237 13.4992待校正吸管实际容量（l ）=举例：空瓶重 21325g，水银连瓶重 21599g 室温 20则： 即实际容量偏高 1%如容量误差不超过 1，即可使用，否则应废弃不用。2试剂问题(1)测定某些含有病理性蛋白血液 Hb 时，试剂的处理前已述及。经典的 HiCN 法的试剂有两种：都氏液和文齐氏液。前者含 NaHCO3，呈碱性，病理血液(肝硬变、白血病、肾病 )加入后不易产生混浊，但需在15条件下 40 分钟后才使 Hb 完全转化成 HiCN。文齐氏液虽显色快，但因是低离子强度溶液，且其 pH值接近病理球蛋白的等电点而易产生混浊。围绕着? 上述问题许多学者做了深入的研究。Vanzitti 发现产生混浊的蛋白属优球蛋白，其特点是溶解度低，在低离子强度溶液中易沉淀。正常人血浆在 pH4565 环境中可发生混浊，而病理血清则在 pH70 条件下发生。进一步研究证实，如在试剂中加入NaCI 以增加其离子强度，可抑制这种混浊发生。但 Mafsufoara 发现，在加入 NaCI 抑制沉定的同时，也改变了 HiCN 的 Q 值，以致影响了测定结果的准确性。为此可以通过调整 KH2PO4 的浓度，改变 PH 范围，使 Q 值仍保持在正常的 159163 范围内。目前日本等国使用的松原试验，即基于此种原理制成，其配方为：K3Fe(CN)6200mg 加 KCN50mg,加 KH2PO4120mg，加 NaCl 5g，加非离子表面活性剂 051ml，加蒸馏水至 1000ml。(2)对碳氧血红蛋白(HbCO) 转化问题： Berens 等报道 Hb-CO 的存在，可影响测定结果，因为 HbCO 转化为HiCN 缓慢，有时几个小时转化还不完全，且 HbCO 在 540nm 时的摩尔吸光系数比 HiCN 大 32。在吸烟者(血中 HbCO 浓度高达 20)或接触 CO 者测定 Hb 时，可使结果偏高。Taylor 提出延长转化时间至 3小时，或将试剂中 K3(Fe(CN)6)浓度加大 5 倍，(可使转化时间缩短至 5 分钟)均可得到满意的结果(3)试剂合格的指标：外观应为淡黄色透明溶液，如有变混变绿现象，即应废去不用。 pH 低于 70 时应进行调整，否则与 Hb 混合后可引起混浊，同时 Hi 不易与 CN 结合，而 KCN 易在酸性条件下以 HCN6形式逸出。在波长 540nm 处，光径为 lcm，以水作空白，试剂 A0。都氏液较稳定，4条件下可保存一年。文齐氏液不易长期保存，应放在棕色玻璃瓶中，于 4冰箱内保存。(4)对含 KCN 的商品试剂的使用：以上介绍的 HiCN 的操作。计算及注意的问题针对的是经典的 HiCN(即血与文齐氏液或都氏液混合后的 HiCN)，而非对所用的含 KCN 试剂都适? 用。已经证明，目前国内外出售的某些商品试剂虽含 KCN，但实际产物并非 HiCN。如有些商品试剂内含溴代十六烷，HCN 及一些表面活性剂，该试剂与血液反应的产物吸收光谱特点与 HiCN 不同，此时结果计算就不能使用 3677 这个常数。在仪器校正时更应注意此问题。(5)注意事项：血红蛋白中，KCN 为剧毒药品。虽然浓度较低，但在配制和保存过程中必须提高警惕，防止污染，严禁口吸。氰化钾必须按剧毒药品管理规定保管。比色后，废液可按每升加次氯酸钠液(即安替福民) 约 35ml比例混匀，敞开过夜，使 CN-氧化成 CO2 和 N2 挥发，或水解成 C032-和 NH4，再排入下水道。C1OCNCNOC1 2CNO3C1O2H 2O2CO 2N 2十 3C1十 2OH CNO2H 2OCO 32-NH 4 血红蛋白不能贮存在塑料瓶中，否则 CN下降，使结果偏低。分光光度计的波长、狭缝、杂光和比色杯光径，均应校正。标准曲线或 K 值应定期检查，校正。3、质控物问题(1)HiCN 参考液是制备标准曲线，计算 K 值，校正仪器和其它测定方法的关键物质。ICSH 已公布了制备方法和严格的规格。参考品规格如下：波峰 540 土 1nm。波谷 504502nm。A540A504 应在159163 间。A7500002。棕色容器保存，稳定期长，4下至少保存 6 年。无菌试验(包括厌氧培养)阴性。测定精度土 1。定值由指定的多个参考实验室测定。(2)开展室内质量控制是提高血红蛋白测定准确性重要环节。目前采用的质控物有：全血质控物。可采用新鲜库血或静脉采血用 ACD 或 CPD 保养液抗凝，混匀后分装在紧塞小瓶中，储存 4冰箱内。全血质控物血红蛋白和红细胞计数仅可稳定 5 周。半固定醛化红细胞。这是目前认为既可作血红蛋白又可作红细胞计数的质控物。可采用过期库存血(但不得超过 30 天)，储存在 4环境中，保存期为 5060 天。冻干全血。全血质控物经冰冻干燥后，保存时间较长。溶血液质控物是最常用的 Hb 测定质控物。取献血员抗凝血，用三倍量生理盐水洗涤 3 次，除去上清液及白细胞层，最后一次以 3000r/min 离心 30 分钟，倒去上清液，加其半量的蒸馏水，振摇 30 分钟，7促使红细胞溶解。移入分液漏斗，加入 15 体积量的甲苯，振摇 30 分钟，除去红细胞膜和脂质。分离出清晰的溶血液，先用 3 号玻砂漏斗过滤，最后在无菌操作下用 6 号玻砂漏斗过滤，并分装在紧塞小瓶或安瓿内，储存于 4冰箱中。该溶血液质控物较为稳定，可保存半年以上。近年来，血红蛋白质控已在全国展开，需要生产大量的 Hb 质控液，Hb 校正液。这些制品不但需要大量的人血为原料，也易造成某些血行传染病(如：乙、丙肝；艾滋病) 的传播，因此有人以猪血代替人血用于 Hb 质控，实验表明收到了满意的结果。用猪血制备的 HiCN 液， 吸收光谱完全符合 ICSH 颁布的标准。将猪 Hb 质控液用于不同的常规 Hb 方法，可得到与人血同样的结果。猪血来源容易，取血简单，价格低廉并具有人 Hb 同样的质控作用，是人 Hb 质控制品理想的代用品。二、其它 Hb 测定法 (一) 分光光度法虽 HiCN 以其简便、准确、稳定、易于质控等优点；成为国际推荐的标准法，但试剂的毒性，妨碍了该法的普及使用。近年来由于表面活性剂在临床检验中的广泛应用，屡有文献介绍新的测定法，在常规工作中作为 HiCN 替代方法。下面简单介绍几种常用的方法。1碱羟高铁血红素(AHD 一 575)法原理此法由 Eander 于 1984 提出。非离子化去垢剂碱性溶液 (AHD 试剂) 能使血红素、血红蛋白及其衍生物全部转化为一种稳定碱性羟高铁血红素，在 575nm 处有一特征性的吸收峰。试剂本试验所用反应液可于下列配方中任选一种：TritonX-100 25g，加 0.1molLNaOH 至 1000ml。皂素 1g 加 0.lmolLNaOH 至 1000ml。Brij 一 35 25g，0.1molLNaOH 至 1000ml。操作取血 20l加到上述任何一种 3ml 反应液中，充分混和，静置 3 分钟。分光光度计(带宽应小于 8nm)波长 575nm 处，吸收池光径 10cm，以反应液调零，测定吸光度(A) 。计算氯化血红素是一种稳定的化学结构已知的化合物，可用来在碱性羟高铁血红素法中标定血红蛋白，其摩尔吸光系数为 6958。血红蛋白浓度在 2.7 一 29.08d1 范围内，氯化血红索浓度与吸光度之间呈线性关系。8式中64458 是目前国际公认的血红蛋白分子量。4 是一分子血红蛋白含有血红素的分子数151 是血液稀释倍数。氯化血红素虽然可以依靠商品供应或自制，但其纯度均不高，前高纯度的氯化血红素又是 AHD 一575 法标准化的先决条件，所以必须加以提纯。提纯方法不算困难，但较麻烦。此外，由于仪器差异，使用上述公式必须十分慎重。比较简便的方法就是用 HiCN 法标定血液标本的血红蛋白浓度后，再来绘制本试验的标准曲线。2叠氮高铁血红蛋白(HiN3)测定法原理红细胞溶解后释放的 Hb 被 K3(Fe(CN)6)氧化成高铁血红蛋白，后者与叠氮钠反应，生成 HiN3 根据以HiCN 法制作的标准曲线，求出 Hb 值。反应式 为：HbK 3Fe(CN)6HiHiNaN 3HiN 3试剂：NaN 330mg，K 3Fe(CN)6200mg，Na 2HPO412H2O800mg，KH 2PO4140mg，加蒸馏水至 100ml，再加 TritonX-100lml。方法准确吸取 NaN3 血红蛋白转化液应用液 5ml，加入指血 201，充分混匀。3 分钟后，以 40nm，光径 1.0nm，以试剂应用液或蒸馏水调零，测定标本吸光值“A”。与同样处理的已知 HiCN 法定值的血样比较或查标准曲线，即可得血红蛋白浓度。标准曲线作法如下：取不同浓度抗凝血或血红蛋白溶液数份，分别用 HiCN 法和 HiN3，法测定每管血红蛋白浓度和吸光度。以 HiCN 法测定 Hb 浓度为横坐标，以 HiN3 法测定吸光度为纵坐标，绘制标准工作曲线。注意事项有报导 NaN3。管理不当易引起爆炸，故 NaN3 试剂应注意保存。虽 HiCN 与 HiCN3，吸收光谱的吸收峰几乎是重合的，但为了严格实验标准，仍需绘制 HiNs 标准工作曲线，不可以其“A”值乘以 367.7 求得 Hb 含量。9（二）自动 Hb 测定仪法目前，国内使用的自动 Hb 测定仪有两种形式，即分离式和组合式。前者是单机只进行 Hb 测定；后者是与其它血细胞项目的测量组合在一起，成为各种型号的血液分析仪(常称血球计数仪) 。两者测试原理相同，均为在溶血剂作用下，红细胞溶解，释放的 Hb 与试剂中的某一成份形成衍生物，在 540nm 波长下进行测定。现将实验中要注意的几个问题说明如下。1近年来，国内引进了大量配有特殊溶血剂的血液分析仪。溶血剂一方面可以破坏红细胞使 Hb 释放，并与溶血剂中的其它成份反应，形成 Hb 衍生物，进行定量。另一方面则可悬浮血细胞以进行白细胞计数。由于各种溶血剂配方不同，转化的 Hb 衍生物也不同。图 1 是几种溶血剂转化液后的吸收光谱曲线。可以看出没有一条完全曲线符合 HiCN。为了统一国内标准，所用仪器均需校正。仪器一旦校准，不得再调。2对白细胞总数明显增高的患者 Hb 测定时应注意有些淬血剂，特别是溴代十六烷基三甲胺，可使 Hb 转化液混浊而导致 Hb 铡定值明显升高。有人曾对无白细胞及全白细胞5000mm3、10000mm3、20000mm3 、30000mm3、50000mm3 不同的 Hb 液用十六烷基测 Hb 并进行了离心前后比较；结果表明，白细胞在 20000 以上就可使 Hb 为 15g 的 Hb 液测定值长高1g，30000 时升高 2g，50000 时升高 3g以上，但这些转化液离心后再测定，与无白细胞者无明显差异。实验表明；白细胞在 20000 以上时，Hb 转化液离心后再测定，才能保证结果可靠。3Hb 测定仪应定期校正 Hb 测定应用光电比色原理，随着使用时间延长，光源灯泡逐渐老化、衰变，而影响实验结果。Hb 测定仪使用一段时间或维修后均应校正。4Hb 测定仪流动池应定期清洗 Hb 仪流动池的定期清洗非常重要。如 Erma PC603图 1 四种溶液血剂形成的 Hb 衍生物吸收光谱10血细胞计数仪的清洗步骤如下：将装有清洗剂的杯子只放在 Hb 管下(也就是外电极) ，另一装有稀释剂的杯子放在小孔管下，按“起动” 键，使清洗剂吸入流动池中。放置 30 分钟后，取下杯子，再按“起动”键，使空气进入逐动清洗剂，反复两次。然后再将含有稀释液