pcr技术发展概述

临床实验室中 ,PCR技术及其应用江苏大学 周滔提纲 病毒性心肌炎的临床实例分析 柯萨奇病毒的实验室检测方法 引申 ,PCR技术 ,以及 DNA测序六月 ,18区 30床女病人 主诉 :上感 (鼻塞 ,轻微咳嗽 ,无痰 ,无咽痛 ),乏力 (需扶墙走 , 不能拿东西 ),头晕 .体温38.5C 体征 :胸痛 (瞬间痛 )无胸闷 ,发痛前有牙龈肿痛两周 ,未见脓 ,未闻及心包摩擦音 ,奔马律 .BP:92/62mmHg,P:92/min. 六月 30日入院时 :2,3,aVF导联抬高0.2mV. CK 503U/L,CK-MB 56U/L.(当时未查Tro) 7月 2日 :K 3.1(3.5-5.5)mmol/L,Tro 5.27 (0-0.1)mmol/L,CK-MB 79.44(0.00-16.00)mmol/L,CK 1123.0(20-200)U/L,hs-CRP 11.53(0.0-3.00)mg/L. ECG: , ,aVF导联提示下壁 ST段抬高;V4,5,6提示心尖导联抬高 . 好转以后 T波倒置 ,异常 Q波 ,有演变表现 心超 :收缩功能下降 ,室壁活动下降 ,无间断性 ,普遍的活动降低 . 病毒性心肌炎 ? 急性心肌梗死 ?初步诊断 甲强龙腎上腺皮质激素 ,下调免疫反应 .(渐停 ) 罗氏芬 ,抗感染 . 多巴胺 ,强心升血压 VitC ,VitB6,二磷酸果糖 ,营养心肌 Kcl,Mgcl2采取措施实验室后继推荐检查 病毒抗体效价滴定 :Ab效价 640?(320为可疑 ) ELISA 查柯萨奇病毒 IgM,IgG. PCR作为临床科研常用的基因诊断方法,其扩增片段的特异性主要由引物决定 ,所以设计引物成为PCR成功的关键 . 在此 ,以柯萨奇病毒B3(CVB3)为例柯萨奇病毒B组 3型GenBank:AY752944.2球形 ,衣壳 20面体 ,核心为单正RNA病毒 ,有衣壳蛋白 (VP)编码编码 VP1tgtcaggctattgaaggacactcctttcatttcgcaggaaaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctatagggagagttgcggat TaqII|taccagataaagttgattcatacgtgtggcaaacatctacgaatcccagtgtgttttggaccgagggaaacgccccgccgcgcatgtccataccgttttt 3000atggtctatttcaactaagtatgcacaccgtttgtagatgcttagggtcacacaaaacctggctccctttgcggggcggcgcgtacaggtatggcaaaaa2910 2920 2930 2940 2950 2960 2970 2980 2990 AhdI PfoI| |gagcattggcaacgcctattcaaatttctatgacggatggtctgaattttccaggaacggagtttacggcatcaacacgctaaacaacatgggcacgcta 3100ctcgtaaccgttgcggataagtttaaagatactgcctaccagacttaaaaggtccttgcctcaaatgccgtagttgtgcgatttgttgtacccgtgcgat3010 3020 3030 3040 3050 3060 3070 3080 3090 tatgcaagacatgtcaacgctggaagcacgggtccaataaaaagcaccattagaatctacttcaaaccgaagcatgtcaaagcgtggatacctagaccac 3200atacgttctgtacagttgcgaccttcgtgcccaggttatttttcgtggtaatcttagatgaagtttggcttcgtacagtttcgcacctatggatctggtg3110 3120 3130 3140 3150 3160 3170 3180 3190 ctagactctgccaatacgagaaggcaaagaacgtgaacttccaacccagcggagttaccactactaggcaaagcatcactacaatgacaaatacgggcgc 3300gatctgagacggttatgctcttccgtttcttgcacttgaaggttgggtcgcctcaatggtgatgatccgtttcgtagtgatgttactgtttatgcccgcg3210 3220 3230 3240 3250 3260 3270 3280 3290 atttggacaacaatcaggggcagcgtatgtggggaactacagggtagtaaatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtgggaaagt 3400taaacctgttgttagtccccgtcgcatacaccccttgatgtcccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccctttca3310 3320 3330 3340 3350 3360 3370 3380 3390 .aaactttttccagggcccagtggaagacgcgataacagccgctataggga.K L F P G P S G R R D N S R Y R E N F F Q G P V E D A I T A A I G R T F S R A Q W K T R * Q P L * G .tttgaaaaaggtcccgggtcaccttctgcgctattgtcggcgatatccct.5-.ggtagtaaatagacatctagctaccagtgctgactggcaaaactgtgtgtggga. .G S K * T S S Y Q C * L A K L C V G V V N R H L A T S A D W Q N C V W E * * I D I * L P V L T G K T V C G K.ccatcatttatctgtagatcgatggtcacgactgaccgttttgacacacaccct.3-5- 3-CVB3 VP1基因序列G+C=13,A+T=7 Tm=(52+14)-5=61G+C=12,A+T=8Tm=(48+16)-5=59keynote 一般引物长度为 1830碱基 GC含量 ,在 4060%左右 退火温度 引物自身不应有发卡结构决定引物退火温度（ Tm值）最重要的因素就是引物的长度在引物长度小于 20bp时：4(G+C)+2(A+T)-5在引物长度大于 20bp时：62.3 +0.41 (%G-C)-500/length-5引物越长，它退火结合到靶 DNA上形成供DNA聚合酶结合的稳定双链模板的速率越小引物 3端是延伸开始的地方 ,所以不可以有连续的 gggccc的序列keynote 扩增基因片段要大于 1个 ORF,常选择 150bp以上Forward Primer length:20bpGC含量 13/20=65%Tm initial/Tm final : 34. / 64.6Reverse Primer length:20bpGC含量 :12/20=60%Tm initial/Tm final : 34./ 60.5总结 PCR扩增目的基因片段 ,关键在于一对引物的设计 ,而引物的设计要同时满足多个条件 ,尤其是当目的片段基因 GC/AT含量明显有倾向时 ,就要在倾向一侧加 A,T或者 GC,来达到合适的 GC含量 ,但是又不能有发卡结构 ,又要保证特异性 扩增的片段要进行检测 ,可以跑条带 ,和 marker做比对 ,但是往往后续实验常用限制性内切酶继续修饰两端 ,达到和其他基因或者质粒连接的目的非编码区的数量与生物进化程度有密切关系，在微生物中，非编码区只占整个基因组序列的 10%20 ；但在高等生物和人类 基因 组中，非编码序列则占了基因组序列的绝大部分。在非编码区还存在大量的重复 DNA序列，这些 DNA看似没有意义也不能编码蛋白质，却能形成特殊的 DNA高级结构，并以此调节附近基因的活性。对非编码区的一个主要研究方向是对调控元件的研究。因为在非编码区，只有一小部分已被证实为有用成分，能帮助基因开启和关闭以调控基因的表达，即调控 DNA,也称为启动子。序列捕获芯片技术用微乳滴 PCR(emulsion PCR, emPCR)来生成扩增产物 . 将固化引物的微球与单链 DNA文库模板以及必要的 PCR反应化合物一起混合 , 微球与文库片段的比例适当 , 以确保大多数微球结合的单链 DNA分子不超过一个 . 水溶液与油混合形成油包水结构乳滴 . 每个乳滴都是一个进行后续 PCR反应的微型化学反应器 . 经过多轮热循环 , 每个微球表面都结合了数千个相同的 DNA拷贝 . 然后打破微乳滴后 , 扩增微球被收集、富集并固定在一个平的玻璃基板上形成一个无规则的阵列 . 转移并放置到刻有规则微孔阵列的微孔板上 . 每个微孔只能容纳一个微球 . 微孔板被安装成为流通池的一部分 . 其中一面可以通过测序反应的化合物 , 另一面则与 CCD光学检测系统的光纤部件相接触