原核生物的基因重组

第六节 原核生物的基因重组基因重组 （ gene recombination）：将两个不同性状个体的基因通过一定的方式转移到一起，并发生重新组合，产生新的遗传性状的过程，称为基因重组 (gene recombination)或遗传重组。 重组 ： 遗传物质在 分子水平 上发生的交换；杂交 ： 在 细胞水平 上遗传物质的交换 .杂交必然包含着重组，但重组不仅限于杂交这一形式。原核生物的基因重组类型 4种形式： 1）转化2）转导3）接合4）原生质体融合一、 转化（ transformation）定义 ： 受体细胞直接吸收供体细胞的 DNA片段 , 并与其染色体同源片段进行遗传物质交换，从而使受体细胞获得新的遗传性状的现象。 转化子（ transformant） ： 经转化后出现了供体性状的受体细胞称为 转化子 ， 即转化成功的菌落。 目前已知有二十多个种的 G+和 G-细菌具有自然转化的能力此过程可以发生在土壤和海洋环境中，可能是自然界遗传交换的重要方式。自然遗传转化（ natural genetic transformation）人工转化（ artificial transformation）感受态细胞 （ competent cell） ： 具有摄取外源DNA能力的细胞1. 感受态感受态：是指受体细胞最易接受外源 DNA片段并能实现转化的一种生理状态。一个细菌能否出现感受态是由其遗传性决定的，但受环境条件的影响也很大，因而表现差别很大。 感受态因子： 调节感受态的一类特异蛋白，它包括三种主要成分：膜相关 DNA结合蛋白、细胞壁自溶素和几种核酸酶。 自然感受态与人工感受态的不同？自然感受态 的出现是细胞一定生长阶段的生理特性（如肺炎链球菌的感受态出现在对数生长期）受细菌自身的基因控制人工感受态 则是通过人为诱导的方法，使细胞具有摄取 DNA的能力，或人为地将 DNA导入细胞内。（ 该过程与细菌自身的遗传控制无关！ ）进行自然转化，需要二方面必要的条件：（ 1）建立了 感受态的受体细胞（ 2）外源游离 DNA分子感受态的机理研究：局部原生质体化假说：处于感受态的细胞局部失去了细胞壁，使外源 DNA能顺利经膜进入菌体。酶受体假说：受体细胞表面出现了一种能结合 DNA并使之进入细胞的酶。2. 转化模型（ 1）转化因子本质是离体的 DNA片断或质粒 DNA 。转化因子进入细胞前还会被酶解成更小的片段，约 8kb。 在不同的微生物中，转化因子的形式不同， dsDNA,ssDNA.革兰氏阴性的嗜血杆菌中，细胞只吸收 dsDNA形式的转化因子，但进入细胞后需经酶解为 ssDNA，才能与受体菌的基因组整合；革兰氏阳性的链球菌和芽孢杆菌中， dsDNA的一条链必须在胞外降解，只有 ssDNA形式的转化因子才能进入细胞。但不管何种情况，最易与细胞表面结合的仍是 dsDNA。由于每个细胞表面能与转化因子相结合的位点有限（如肺炎链球菌约 10个），因此，从外界加入无关的 dsDNA就可竞争并干扰转化作用。质粒 DNA也是良好的转化因子，但它们通常并不能与核染色体组发生重组。 转化的频率通常为 0.1 1，最高为 20。 (2) 转化过程 供体 (strR)ds DNA感受态受体 (strS)酶解与吸收单链同源区段配对单链整合复制与分离转化子 (strR) 非转化子 (strS)肺炎链球菌转化的主要过程 转化因子进入细胞 转化因子单链配对与整合 复制 分离 自然转化过程的特点：a） 对核酸酶敏感；c） 转化是否成功及转化效率的高低主要取决于转化（ DNA）给体菌株和转化受体菌株之间的亲源关系；d） 通常情况下质粒的自然转化形成转化子效率要低得多；提高质粒的自然转化效率的二种方法：1）使质粒形成多聚体，这样进入细胞后重新组合成有活性的质粒的几率大大提高；2）在质粒上插入受体菌染色体的部分片段，或将质粒转化进含有与该质粒具有同源区段的质粒的受体菌 -重组获救b） 不需要活的 DNA给体细胞；定义： 噬菌体 DNA被感受态细胞摄取并 产生有活性的病毒颗粒。4. 转染 (transfection)：现在把 DNA转移至动物细胞的过程也称转染提纯的噬菌体 DNA以转化的（而非感染）途径进入微生物细胞并表达后产生完整的病毒颗粒。特点：5、人工转化用 CaCl2处理细胞， PEG介导、电穿孔、基因枪法 等是常用的人工转化手段（使细胞膜更易于透过 DNA ）。在自然转化的基础上发展和建立的一项细菌基因重组手段，是基因工程的奠基石和基础技术。不是由细菌自身的基因所控制；用多种不同的技术处理受体细胞，使其人为地处于一种可以摄取外源 DNA的 “人工感受态 ”。质粒的转化效率高 （不像线型 DNA 那样易于降解，而且还能在宿主中复制。任何来源的 DNA 将其连接到质粒上都能进入受体细胞） .二、转导（ transduction）转导： 利用完全或部分缺陷噬菌体为媒介，把供体细胞的小片段 DNA携带到受体细胞中，通过交换与整合，使后者获得前者部分遗传性状的现象。 由转导作用而获得供体细胞部分遗传性状的重组受体细胞称为 转导子 （ transductant）携带供体部分遗传物质（ DNA片段）的噬菌体称为转导噬菌体。 细菌转导的二种类型：普遍性转导局限性转导1、普遍性转导（ generalized transduction）通过极少数完全缺陷噬菌体对供体菌基因组上任何小片段DNA进行误包，而将其遗传性状传递给受体菌的现象，称普遍性转导。 (1) 意外的发现1951年， Joshua Lederberg和 Norton Zinder为了证实大肠杆菌以外的其它菌种是否也存在接合作用，用二株具不同的多重营养缺陷型的鼠伤寒沙门氏菌 LT22A(trp-)（ P22） 和 LT2(his-)进行实验：用 “ U” 型管进行同样的实验时，在供体和受体细胞不接触的情况下，同样出现原养型细菌！沙门氏菌 LT22A(trp-)是携带 P22噬菌体的溶源性细菌另 一株 LT2(his-)是非溶源性细菌一个表面看起来的常规研究却导致一个惊奇和十分重要发现的重要例证！基因的传递很可能是由可透过 “U”型管滤板的P22噬菌体介导的 (在接种 LT22A的一端出现了原养型 )（普遍性转导这一重要的基因转移途径的发现）(2) 转导模型转导噬菌体为什么 “ 错”将宿主的 DNA包裹进去 ?噬菌体的 DNA包装酶 也能识别染色体 DNA上类似 pac的位点并进行切割，以 “ headful” 的包装机制包装进 P22噬菌体外壳，形成只含宿主 DNA的转导噬菌体颗粒 （假噬菌体） 。因为染色体上的 pac与 P22 DNA的 pac序列不完全相同，利用效率较低，这种 “ 错装 ” 机率一般仅约 10-6-10-8形成转导颗粒的噬菌体可以是温和的，也可以是烈性的，但必须具有能偶尔识别宿主 DNA的包装机制，并在宿主基因组完全降解以前进行包装。普遍性转导的基本要求：普遍性转导的三种后果：进入受体的外源 DNA通过与细胞染色体的重组交换而形成稳定的转导子流产转导（ abortive transduction）转导 DNA不能进行重组和复制，但其携带的基因可经过转录而得到表达。特点：在选择培养基平板上形成微小菌落外源 DNA被降解，转导失败。如果受体菌通过普遍转导获得了供体菌 DNA片段后，在其体内不发生基因的交换、整合和复制，只进行转录、翻译和性状的表达。这种转导被称为流产转导 .2. 局限转导（ restricted transduction） 定义： 通过部分缺陷的温和噬菌体把供体菌的少数 特定基因携带到受体菌中，并与后者的基因组整合、重组，形成转导子的现象。媒介： 部分缺陷噬菌体 （丢失自身一部分基因，并被同等长度的宿主基因所取代）只能转导个别特定基因 大肠杆菌中 噬菌体的正常裂解及半乳糖基因转导噬菌体的形成过程低频转导（ LFT） 的定义 : 诱导溶源性大肠杆菌而产生的细胞裂解产物中，除含有正常的噬菌体外，还有少数（ 10-6）转导噬菌体颗粒，因此，用诱导 溶源性菌株得来的噬菌体进行转导时的转导频率不过 10-6 ， 称为低频转导 。高频转导 (HFT):如果细菌染色体中整合有一个正常的 噬菌体时，缺陷 噬菌体也能整合到同一细菌染色体上 （因为正常噬菌体整合后，产生两个细菌 /噬菌体杂合 att位点，缺陷 噬菌体可以在该位点插入），这种细菌称为双重溶源菌 .双重溶源菌中，正常 噬菌体称为 辅助噬菌体 ，因为它帮助缺陷噬菌体整合和繁殖。双重溶原菌 在紫外辐射等因子的诱导下 ,原噬菌体容易被切割下来， 产生等量的缺陷噬菌体和正常噬菌体，该裂解物称为高频率转导裂解物 ，用这样的裂解物去感染细菌，将比低频率转导裂解物产生多得多的转导子。这一过程称为高频转导。大肠杆菌的低频转导和高频转导比较： uvE.coli K12( ) LFT 裂解物 dg(10-5 10-6) 转导噬菌体 uvE.coli K12(/ dg) HFT裂解物 50% (双重溶源菌 ) 50% dg转导噬菌体低频率转导 （ LFT） ： LFT裂解物E.coli gal- E.coli gal- / dgal+ （ 极少量转导子菌落 )E.coli gal-高频率转导 (HFT) ： HFT裂解物E.coli gal- E.coli gal- / dgal+ （ 50% 转导子菌落 )E.coli gal-（ 50%）普遍转导与局限转导的特性比较普遍 转导 局限 转导转导 的 发 生 自然 发 生 人工 诱导 （ uv）噬菌体形成 误 包 前噬菌体的 “误 切 ”内含 DNA 只含宿主 DNA 含噬菌体和宿主 DNA转导 性状 供体的任何性状 前噬菌体两端 邻 近 基因转导过 程 双交 换 （ 转导 DNA 替 换 受体 DNA 同源区）转导 DNA插入，使受体菌 为 部分二倍体溶源转变（ lysogenic conversion）：一个与转导相似又不同的现象定义 :温和噬菌体感染细胞后使之发生溶源化，因噬菌体的基因整合到宿主染色体上，而使后者获得了新性状的现象。溶源转变与转导的不同？a） 噬菌体不携带任何供体菌的基因；b） 这种噬菌体是完整的，而不是缺陷的；三、 接合 (conjugation)通过细胞与细胞的直接接触而产生的遗传信息的转移和重组过程1.接合现象的发现和证实 1946年， Joshua Lederberg 和 Edward L.Taturm细菌的多重营养缺陷型杂交实验中间平板上长出的原养型菌落是两菌株之间发生了遗传交换和重组所致！为了减少所培养的结果是回复突变的机会，采用了双重或三重营养缺陷型。该实验是建立在不大可能同时发生两种或三种回复突变的设想上的。证实接合过程需要细胞间的直接接触的“U”型管实验（ Bernard Davis， 1950 ）2. 能进行接合的微生物种类 主要在细菌和放线菌中存在。 在细菌中， G 细菌尤为普遍，如 E. coli、 沙