实验3西瓜染色体加倍和鉴定

实验三 西瓜染色体加倍和鉴定遗传学 1l 一、实验目的：l 学习应用秋水仙碱溶液诱发四倍体西瓜的方法（ 西瓜幼苗直接加倍法 和组培苗离体培养加倍法）；观察鉴定四倍体西瓜的形态特征及其细胞学特点。遗传学 2二、实验原理用 秋水仙碱 的水溶液处理二倍体（ 2X） 西瓜的分生组织 可以 抑制细胞分裂时纺锤体的形成 ，使细胞不能分裂为二，但不影响染色体的复制 染色体复制加倍，而细胞没有分裂 以致 细胞内染色体数目成倍地增加 ，形成为四倍体细胞 产生四倍体组织 进而获得四倍体植株（ 4X）。四倍体植株的性母细胞经减数分裂所产生的雌雄配子以 2X为主 通过受精又可成为 四倍体植株 。当以四倍体西瓜为母本，与二倍体西瓜杂交 可以生产 3X无籽西瓜 。遗传学 3秋水仙秋水仙遗传学 4l 临床临床 应用：应用： 治疗乳腺癌、肺治疗乳腺癌、肺癌、胃癌、皮肤癌及慢性粒细癌、胃癌、皮肤癌及慢性粒细胞白血病，缓解痛风的急性发胞白血病，缓解痛风的急性发作。作。l 毒副作用较大，口服毒副作用较大，口服 6毫克秋毫克秋水仙碱即可致人死亡。水仙碱即可致人死亡。l 急性中毒症状：急性中毒症状： 剧烈腹痛、剧烈腹痛、腹泻、恶心、呕吐，严重者可腹泻、恶心、呕吐，严重者可致呼吸中枢麻痹而死亡。致呼吸中枢麻痹而死亡。l 慢性中毒：慢性中毒： 对骨髓造血有直对骨髓造血有直接抑制作用，易引起粒细胞缺接抑制作用，易引起粒细胞缺乏、再生障碍性贫血等。乏、再生障碍性贫血等。l 秋水仙素（从秋水仙球茎中秋水仙素（从秋水仙球茎中提取），能诱导单倍体植株的提取），能诱导单倍体植株的染色体加倍形成多倍体，培育染色体加倍形成多倍体，培育花卉和农作物新品种。花卉和农作物新品种。秋水仙碱秋水仙碱遗传学 5遗传学 6三、实验材料 二倍体西瓜（ 2n = 2X = 22） 的种子。遗传学 7四、实验方法1.西瓜幼苗直接加倍法2.组培苗离体培养加倍法 遗传学 81. 西瓜幼苗直接加倍法： 将 西瓜种子 小心嗑开，去除种皮 放入 70%酒精 中消毒 10分钟 ，用蒸馏水冲洗 5次 再放入培养皿（ 2层滤纸 +少量蒸馏水）中 在 25-28 下发芽 。 从田间取回肥沃的泥土，在 120 烘箱中干燥消毒24小时 冷却、调湿后装入纸杯（可适当加入一些肥料）。遗传学 9 将发芽 1-2天的种子 胚根朝下 播入泥土中，在25-28 的培养箱或恒温室中生长，每天在泥土表面喷 1-2次水。遗传学 10 在 3-4天后，当苗已长出、两片子叶 张开约 30度角 时，在两片子叶间固定少许棉花 然后在棉花上 滴加浓度为 0.4%的秋水仙碱溶液 ，每隔4小时滴加次 共滴加天。遗传学 11 在 20-30天后，当 西瓜苗长有 3片左右真叶时移栽到大田 ，株距大于 50厘米。此时气温最好能稳定在 25 以上（ 4月中旬）。遗传学 12 在移栽后 40天左右（ 5月下旬），当西瓜开花时，每株 取若干雄花花蕾 进行减数分裂观察，鉴定是否加倍成功。二倍体西瓜四倍体西瓜遗传学 13 开花后 30天左右（ 6月下旬），当西瓜基本成熟时， 观察比较不同倍性西瓜 的株型和瓜型的形态特征。遗传学 14多倍体的鉴定： 用秋水仙素溶液处理后，应注意观察多倍体植株。若形成多倍体，它萌芽的肥厚度明显增加，幼根尖端发生膨大现象； 考察植株的体型，多倍体具有体型较大的特点。如叶片较大，根茎变粗，花、果实、种子都较大，茎叶组织比较粗糙，颜色深绿，有时有皱缩现象； 四倍体叶面的气孔较大，单位面积气孔数目相对减少，花粉粒较二倍体的花粉粒大一倍以上； 直接在显微镜下检查染色体数目是否已经加倍 (普通二倍体西瓜 2X = 22，四倍体西瓜 4X = 44)。 遗传学 152. 组培苗离体培养加倍法 培养基的配制：西瓜种子的 发芽培养基 ： 1/2MS + 0.7%琼脂的固体培养基；诱导和生长培养基 ： MS + BA1.1263mg/L；生根培养基 ： Miller + IAA 0.5mg/L。以上培养基除已说明外 ， 均含 3%蔗糖和 0.7%琼脂 ， 液体培养基则不含琼脂。遗传学 16 无菌苗的准备：种子剥去种壳种子剥去种壳 用用 70%的乙醇浸泡处理的乙醇浸泡处理 1分钟分钟 再用再用 0.1%的升汞处理的升汞处理 10分钟分钟 ， 无菌水冲洗无菌水冲洗 4次次 无菌无菌滤纸吸干后接种滤纸吸干后接种 于于 发芽培养基上发芽培养基上 在培养箱内于在培养箱内于26 ， 光照度光照度 3000lx， 每日光照每日光照 16小时条件下小时条件下培养备用。培养备用。遗传学 17遗传学 18遗传学 19遗传学 20(3) 秋水仙碱处理和茎尖培养：在无菌条件下 ， 切取 8天苗龄 的茎尖 （ 长约 5mm） 放入含 0.1mg/L秋水仙素 的液体诱导和生长培养基中 在 弱射光 下 ， 用摇床以 120r/min的转速 摇动处理 2448小时 然后取出茎尖用无菌水冲洗 1次 再插在相应的 不含秋水仙素的固体诱导和生长培养基上诱导茎尖生长 在与培养无菌苗相同的条件下培养。遗传学 21遗传学 22 生根培养： 4周后根据生长情况，将长成的无根苗剪下转至生根培养基上。 遗传学 23(5) 染色体鉴定：生根后切取根尖鉴定植株倍性。根尖制片方法如下 ：幼根用 0.002 M 8-羟基喹啉溶液处理 4小时 用新配制的卡诺氏固定液（ 100 %乙醇 冰醋酸 =31 ）固定 24小时 然后放入 1N盐酸，在 60 恒温水浴锅中解离 10分钟 （注意：不能超过 10分钟！） 。遗传学 24处理后的根尖置于载玻片上，用刀片 切去根尖最前端 0.5毫米 的根冠和伸长区 然后切取 少于 1毫米 的分生组织，滴一滴 改良苯酚品红 染色液 半分钟后盖上盖玻片，用手指按住盖玻片一角（手指下