常用中药的生物鉴定-pcr

常用中药的生物鉴定之聚合酶链式反应常用中药的生物鉴定方法 免疫鉴定法 电泳鉴定法 生物效价鉴定法 单纯指标鉴定法 细胞生物学鉴定法 DNA遗传标记鉴定法 mRNA差异显示鉴定法聚合酶链式反应 (Polymerase Chain Reaction)，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的 DNA片段。可看作生物体外的特殊 DNA复制。少量 DNA 样品快速扩增 amplify技术。(invented by Kary Mullis , won a Nobel Prize in Chemistry in 1993 )原 理PCR 要 件模板 Template 引物 Primers:Small pieces of DNA.Made up of 15 to 30 bases. Binds the DNA at a specific region.forward and reverse 正向和逆向酶 Enzyme:Taq DNA polymerase PCR核酸 Nucleotides: Substrate, four deoxyribonucleotides (A,C,G,T) dNTPMDist H2O 117 ul10X buffer 15 uldNTP 12 ulPrimer 1 3 ulPrimer 2 3 ulTaq polymerase 0.75 ul200ul tubePipette 上下混合取出 15 ul 剩下的加入 3 ul Template DNA用 pipette 上下混合分装 入 tube 15ul/支标 上 1.51 2 3 4 554C 56 58 60 62Run PCRTcTc55 C 不加模板的对照组M 加入 1 ul 模板 DNA不加 引物 但有模板的 对照Pc15 ulMTC3 ul template (T)Pipette mixTC15ul/tubepcPC1 2 3 4 51 ultemplateTTC PC1 2 3 4 554 55 56 57 58 60 62oC RNUProgramDenature 95C 5 minDenaturation变性： 双链 DNA模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链 DNA，一般加热至 9095 , 30 secAnnealing褪火： 系统温度降低，引物与 DNA模板结合，形成局部双链， 55 70 ，固称其为褪火。 most important factor in the PCR ,45secExtension延伸： 在 Taq酶的作用下，以 dNTP为原料，从引物的 5端 3端延伸，合成与模板互补的 DNA链 , 温度为 70 75C, 1.5 minFinal extension 72 C, 5 min2x106优点 :need very small amount of sample缺点 :amplified product may be contaminated with other samples not related to the one Factors affect to PCRvMg +2 concentration,Mg +2 specificity 0.15mmol/L Mg+2 预实验vPrimer(引物 ) specificityDegenerate primer -to find the target gene in the closely related speciesspecificity , nonspecific products vAnnealing TemperatureToo high no PCR productToo low much nonspecific productgradient Temp PCR machine find the suitable Temp vTaq polymerase quality vTemplate(模板 ) DNA qualityPCR产物鉴定Agarose gel electrophoresis to chec