时间分辨荧光免疫技术培训

时间分辨荧光技术广州市源起生物科技有限公司培训主要内容q时间分辨荧光免疫技术（ TRF）定义。 qTRF的标记物及特点。 q为什么叫 “ 时间分辨 ” ? qTRF在免疫分析方法学中的地位。q各种免疫方法学的比较。q临床应用回顾标记免疫学发展回顾标记免疫学发展v 放射免疫 （精度： 10-12mol/L ）v 酶联免疫 （精度： 10-9 mol/L ）v 胶体金标记 （金标 ： 10-15mol/L ）v 化学发光 （精度： 10-15mol/L ） 电化学发光 （精度： 10-17mol/L ）v 时间分辨荧光（精度： 10-18mol/L ）v 生物芯片时间分辨荧光技术时间分辨荧光技术 （ Time-Resolved Fluorescence）v 时间分辨荧光免疫分析时间分辨荧光免疫分析 （ TRFIA）v 时间分辨免疫荧光分析（ TRIFMA）v 时间分辨荧光核酸探针分析v 时间分辨荧光细胞活性分析v 时间分辨荧光探针分析时间分辨荧光技术原理 （ TRF）v 用三价稀土离子及其螯合物作为示踪物，代替荧光物质、同位素、酶和化学发光物质，标记抗原、抗体、激素、核酸探针等物质；v 当免疫反应发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点 （特异性强、荧光光谱的 Stokes位移、寿命长），用时间分辨荧光分析仪，测定免疫反应最后产物的荧光强度。v 根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。时间分辨荧光免疫原理图（ Time-resolved Fluorescence Immunoassay）时间分辨荧光免疫试剂工作原理示意图V标记物轻链螯合剂Eu重链VV标记物为具有独特荧光特性的稀土金属标记物为具有独特荧光特性的稀土金属 -镧系元素镧系元素v 镧系元素共有 15种，应用在时间分辨荧光免疫技术中有四种： 铕 (Eu)、钐（ Sm)、镝 (Dy)、锝 (Te)v 镧系元素荧光特点： 荧光寿命极长v 镧系元素螯合物 （ 60900 us) v 普通荧光免疫中荧光团： 1100usv 样本中蛋白质荧光： 110us，易猝灭。 Stokes位移大（大约 290nm）v 铕：发射光 613nm、激发光 340nm，v 荧光 素的 Stokes位移 为 28nm 荧光特异性强。（发射光谱带很窄： 615 5nm） 解离 -增强技术可使其荧光性提高 100万倍利用镧系元素荧光物理特性，荧光激发后在固定时间段检测特异性荧光而在此时间之前，非特异性荧光已完全衰减为 0时间分辨荧光免疫原理图利用镧系元素利用镧系元素 光谱光谱 特点，将发射特点，将发射 荧光荧光 与激与激发荧光发荧光 分辨分辨 开来，零本底的又一保障开来，零本底的又一保障发射光谱与激发光谱间存在的巨大 Stokes位移。可以通过干涉滤光片将发射光谱与激发光谱完全分离。DELFIA技术为临床检测带来的先进性技术为临床检测带来的先进性技 术 特点 检验 先 进 性时间 分辨光 谱 分辨特异性 荧 光与非特异性 荧 光分离发 射 荧 光与激 发荧 光分离零背景、高特异性解离 -增强荧 光性大大提高稳 定的 荧 光螯合物线 性范 围 更 宽重复性更好原子 标记 标记 位点多，可达 20个对标记 物 结 构及活性影响小无衰 变受 环 境影响小高 稳 定性，高精确度试剂 保 质 期至少一年标 准曲 线 保留 时间长同一批次只需两点定标多 标记 单 ，双，三，四 标记 同一 试剂 盒可同 时测多个 项 目灵敏度更高，检测范围更广灵敏度更高，检测范围更广v 以下数据均出自于各制造厂家自己的产品说明书v 试剂 DELFIA Immulite ACS-180 v AFP 0.1-1000IU/ml 0.2-300IU/ml 1.0-1000IU/ml v CEA 0.1-500ng/ml 0.2-500ng/ml 0.5-100ng/ml v HCG 0.5-10000U/L 5-5000U/L 2-1000U/L v v TSH 0.005-100U/ml 0.002-75U/ml 0.03-150U/mlv FSH 0.05-256mU/ml 0.1-170mU/ml 0.3-200mU/ml v Prog 0.08-120nmol/L 无 0.1-40ng/ml v v Prolactin 0.04-250ng/ml 0.5-150ng/ml 0.3-200ng/mlv 时间分辨荧光免疫检测的标准曲线相当稳定，同一批次的试剂盒可用两点法加批次的参考曲线定标0.5 1 2 5 10 20 50 100 200 500U/L 51002000Cps.10 3DELFIA hFSHN=6标准曲线稳定，试剂保质期时间长放射性免疫分析法（放射性免疫分析法（ RIA）v 应用应用v 放免自 60年代问世以来对临床诊断起了革命性的贡献，是一项较为成熟的诊断技术。v 夹心法、竞争法的标记原理为以后的检测技术的发展奠定了基础。v 缺点缺点v 放射性（ 125 I）， 对环境的污染及对身体的危害，该方法已经为重视环保的国家逐步取消。（如整个欧洲仅尚存几个放免试验室）v 125 I 的半衰期短而导致其试剂有效期短。v 标记物 125 I 的稳定性差，导致试剂盒批间、批内的变异较大；标准曲线有效期短，必须每次定标，造成浪费。v 操作繁琐，出报告时间长。v 无法保存备用。酶免疫分析法（酶免疫分析法（ ELISA ）v 应用应用v 酶免的最大优势在于避免了对环境和人体危害。v 试剂有效期较长。v 衍生技术： 荧光酶免疫分析 增强化学发光酶免疫技术v 曾经一度被认为是取代放免的检测手段。v 缺点缺点v 灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。v 因酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响 ，导致稳定性不好。化学发光免疫分析法（化学发光免疫分析法（ CLIA）v 应应 用用v 单个样本检测速度快，适合做急诊。v 灵敏度较高。v 自动化程度高。v 分类： 以丫啶酯直接标记 ACS180系统 以 HRP标记，鲁米诺为发光底物 Amerlite系统 以 AP为标记物， AMPPD为发光底物 Immulite系统v 缺缺 点点v 发光过程短，样品不能重复检测。v 本底较高，易受环境物质干扰。v 仪器故障率较高。v 试剂稳定性较差，需多次定标。v 检测精度不高，在超微量分析及早期诊断方面能力不足。v 非开放性试剂；试剂价格高。电化学发光免疫分析法（电化学发光免疫分析法（ ECL）v 应用应用v 80年代末期问世的新型化学发光免疫分析方法。v 基本原理：根据三联吡啶钌Ru(bpy)3和三丙胺在电场触发下产生发光的化学发光反应。v 本底较小、灵敏度较高、线性范围较宽。v 缺点缺点v 非开放性试剂系统、不能做科研。v 试剂价格过高。时间分辨荧光免疫的试剂种类v 内分泌科检查 甲状腺系列： TSH， Ultra TSH， T3， T4， FT3， FT4， TBG， TG 糖尿病系列： Insulin， C-Peptie 生长激素类： hGH 其他： Cortisolv 妇产科检查 FSH， LH， HCG， ProlactinE2， E3， Testo， Prog， SHBGv 肿瘤科检查 AFP， CEA， PSA， hTG， -2 Micro， NSE， PAP， PSA（ Free/Total）， PSA EQM， CA-50， CA-125， CA-199， CA-153*， CA-724*， CY-211*v 遗传科检查 产前筛查： hAFP/ HCG ， PAPPA 新生儿筛查： Neo-TSH， Neo-T4， Neo-IRT， Neo-17a-OH Prog， PKU 核酸探针及基因杂交检测，多标记定量 PCR检测。v 肝炎系列 甲肝，乙肝，丙肝v 血液科检测 贫血检查： Ferritin， Vit B12， Folic acid 白血病： 免疫细胞分型等v 细胞学检查 细胞毒试验等多种检测项目，细胞质及组织化学分析等多种检测项目 酶类检测及细胞受体检测（包括 MHC， HLA等多种检测）v 科研工具 单标记检测，双标记检测，三标记检测，四标记检测时间分辨荧光免疫时间分辨荧光免疫 -突出优点突出优点v零本底、灵敏度高v线性范围宽v试剂有效期长v标准曲线稳定性好v易于自动化TRFIA作为一项具有广阔发展潜力的新兴生物学技术，将会给标记免疫学带来一场革命 。时间分辨荧光时间分辨荧光 与与 化学发光化学发光 方法学比较方法学比较时间分辨荧光时间分辨荧光 化学发光化学发光v 发光效率 95% 1% v 重复检测 可无数次 不可重复 v 本底噪声 零本底 干扰大v 灵敏级数 10-18 10-15v 标记物 原子 大分子化合物 v 标记位点 可达 20个 /抗体 1个 /抗体 v 标准曲线 稳定达一年以上 稳定 2 到 4周 v 多标记 有，最多可