旧版pfge脉冲场电泳技术培训-4chef故障排除20140224

脉冲 场电 泳技 术 （PFGE） 培 训王彤宇 培 训 部Mar-2014For Internal Bio-Rad use ONLY!CHEF脉冲 场电 泳的故障排除PFGE Trouble Shooting For Internal Bio-Rad use ONLY!排除 PFGE 凝胶 故障 比 较 复 杂 ，涉及到多种因素 : 实验 室各自的技巧和技能 实验 室 环 境和 设备 条件 试剂 水 质 实验过 程中意外的干 扰 和分心（一） PFGE技 术 故障排除的一般考 虑 因素For Internal Bio-Rad use ONLY!通 过 改正一些不好的 实验 操作 （习惯 ） 能 够 帮助解决部分 PFGE 结 果不佳的困惑 精准地 称量和 定容（ 积 ） 计 算精确 确 认 所有 仪 器 设备处 于良好的工作状 态 检查试剂 化学品不得有沉淀、 变 色、絮状、 过 期 采用正牌厂家的 试剂 耗材 整个 实验过 程中戴手套 确 认 玻璃器皿干 净 ， 不得有清 洁剂 、脏 物碎片等残留，因 为这 些因素可能会影响凝胶小 块 的制 备 、裂解，从而 导 致 结 果背景上出 现 斑点， 脏 点 千万不要使用 质 量差的塑料容器， 除非你确保它能被洗干 净 千万不要 过 分加 热琼 脂糖溶液 配置 酶 混合液 时 要混合充分 处 理每种微生物 实验时 ，采用合适的 试剂 、内切 酶 和 电 泳参数条件（一） PFGE技 术 故障排除的一般考 虑 因素For Internal Bio-Rad use ONLY! 想一想， 对 照上次成功的 实验 ，有哪些因素变 化了？ 过 程方面： 仪 器 设备 试剂 耗材 人力因素 考 虑 操作 规 程中的所有步 骤 ，自 检 式提 问是否故障源自于其中某一个 环节 ？ 考 虑 和 观 察凝胶的每片区域， 试图识别 其中某个区域可能同失 败 的原因有关 联 要做到 这 些， 操作者必 须对 每一步 骤 的的目的很熟悉，以及 对 每一步 错误 的操作可能 带 来的潜在后果明晰（一） PFGE技 术 故障排除的一般考 虑 因素For Internal Bio-Rad use ONLY!（二） 模糊一片的条 带 (Fuzzy or Smeary Bands)Smeary bands affecting samples alone or samples & standardFor Internal Bio-Rad use ONLY!分析： 这 是很典型的假象 造成 原因 是 蛋白 酶 消化 或 核酸内切 酶 切割 不完全 . 只有小胶 块 的外周 边缘 接触到 酶 ，得到了消化，而中心区域的 样 品却未被 处 理到位，所以 样 品 电 泳 结 果象个 “盒子 ” 改 进 建 议 ： 小胶 块 做薄点； 降低制作小胶 块 的 琼 脂糖 浓 度 酶 处 理 时间 适当 延 长 采用新 鲜 酶 试剂 增加 酶 的 浓 度（二） 类 似 现 象 或 称 为 Box Shaped BandsFor Internal Bio-Rad use ONLY!（三）歪曲的条带 (Distorted Bands) 小胶 块 放入 样 品孔 时 没放均匀 稳 妥。它 们应该 填 满 梳孔的整个 宽 度，胶 块 上沿 须 同大的 电 泳凝胶表面 齐 平。 “V” 形 或者 “ check mark” 形的条 带 是由于小胶 块 一端高出另一端而造成的 小胶 块 放到梳 齿 上后， 周 围 液体没吸干 样 品孔在灌制凝胶或拔出梳子 时 不小心扭曲 循 环泵 的流速太慢 检查连 接管路有无扭 结 或堵塞了出入口 .For Internal Bio-Rad use ONLY!（三）歪曲的条带 (Distorted Bands) 现 象： 液体 样 品加 载 到梳孔中， 如果出 现长 方形 宽阔 条 带 或是 【 形， 往往由于顶部的凝胶比底部冷却快的原因，所以条带会倾斜 Liquid samples loaded to the top of the well produce a wide square band or doublet with sides (an open square shape). This is caused by the top of the gel being cooler than the bottom of the gel so that the band runs at a slant.For Internal Bio-Rad use ONLY!（三）歪曲的条带 Distorted Bands微微歪曲的条 带 - 电 极方面的 问题For Internal Bio-Rad use ONLY!（三）歪曲的条带 Distorted Bands歪曲的条 带 - 加 样 方面的 问题For Internal Bio-Rad use ONLY!（三）歪曲的条带 Distorted Bands歪曲的条 带 - 汽泡的原因 ?For Internal Bio-Rad use ONLY!（ 四） 样品没有往下方向迁移 Samples Not Migrating Down the Gel 样 品没有 进 入凝胶 : 如果 标 准 样 品迁移正常的 话 , 有可能 样 品在前 处 理 时 没有 酶 解完全 电 极 问题 检测电 流， 电线连 接， 电 泳 时电 极上的气泡 ，转换电场 方向 时 样 品 虽 然 进 入了凝胶，但在中途停了下来 : 琼 脂糖 类 型和 浓 度 ? 主机 电 源参数有否 变 化 ? (比如 , 输 入 电压值 ，电 流 值 ?) 缓 冲液 类 型和 浓 度 ? 检查电 路 连 接是否完好 . 在 编 有多套固定参数模 块 的方案中， 仪 器 为 第 2套步 骤 自 设 的 电压值为 0.6 V/cm. 用 户 注意需要 为 第 1 套和第 2设 置 电压值For Internal Bio-Rad use ONLY!（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction 原因可能是程序 错误 ，尤其在含有多状 态 参数 组 合的程序中出 错 。因 为 multi-state 模式要求 输 入与垂直方向的 夹 角，一 Samples are not going in the correct direction in the CHEF Mapper, the problem may be a programming error while in the Multi-State mode. The multi-state mode will ask for an angle from the vertical, rather than the included angle. So, for example, the researcher mistakenly programs in 120 degrees, then the sample will run in the wrong direction at a 30 degree angle.For Internal Bio-Rad use ONLY!（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong Direction样 品条 带 整体 偏向左 侧 或右 侧 ， 可能的原因：电 极断裂 Broken electrode or electrodes. 某 对电 极的 电 位有差异电 泳槽的 电 子部分由 问题 ，比如，在槽盖的 电 插座上未 连接通，靠 这 部分通路 连 接主机 电 源部分 建 议测 量 电 极 对 的 电压 /电 流 （拆 、揭开 电 泳槽面 , 24对电线 ）For Internal Bio-Rad use ONLY!（四） 样品迁移方向错误 -条带倾斜For Internal Bio-Rad use ONLY!（四） 样品迁移方向错误 Samples Migrate to the Wrong DirectionFor Internal Bio-Rad use ONLY!Top of gel (wells)Bottom of gelLadders（四） 样 品迁移方向 错误 Samples Migrate to the Wrong DirectionFor Internal Bio-Rad use ONLY!（四） 样 品迁移方向 错误 Samples Migrate to the Wrong Direction样 品条 带 整体 偏向左 侧 或右 侧 ， 可能的原因： 有 时 缓 冲液循 环 回路有 问题 ， 由于 琼 脂糖碎片堵塞引起循 环问题 建 议 凝胶放 稳 在胶框架内，以免 电 泳是 飘 移； 使用 仪 器原配胶框，自制的框不能太厚而阻 挡电 流 使用 挡 胶条， 冲洗清 洁 整个管路和接口 For Internal Bio-Rad use ONLY!（ 四） 样 品迁移方向 错误 Samples Migrate to the Wrong Direction原因： 凝胶外 围 人 为 地加了阻碍物体， 造成 缓 冲液循 环不 畅 、波 动 ，继而 电场 方向受影响For Internal Bio-Rad use ONLY!（四） 样 品迁移方向 错误 Samples Migrate to the Wrong Direction样 品条 带 向外歪斜， 可能的原因：缓 冲液量不 够 ，没有盖没凝胶， 梳孔使用 时间长 了， 产 生弯曲弧度，两 侧 由于 琼 脂糖碎片堵塞引起循 环问题 建 议 加入大 约 2.1-2.2 升 缓 冲 液； 把梳 齿 反 过 来安装在固定架上。For Internal Bio-Rad use ONLY!(五 ) 蛋白酶 K消化步骤不完全没加 Sarcosyl (十二烷基肌氨酸钠）For Internal Bio-Rad use ONLY!(五 )蛋白酶 K消化后没有充分洗胶块以去除碎片杂质 Same plugs washed 6X with TESmearing and incomplete restriction resulting from insufficient washing, 1st figure shows plugs washed 4 times with TE, 2nd shows plugs washed 6 times with TE.Plugs washed 4X with TEFor Internal Bio-Rad use ONLY!问题 : 不完全 酶 切反 应 会造成条 带 “重影 ”或称 “鬼影 ” ，可能的原因 : 小胶 块质 量差 proteinase K 没有清洗去除干 净 DNA 浓 度 过 高 内切 酶 浓 度 内切 酶 商品 / 酶 切 缓 冲液 批次 质 量 问题 内切 酶 商品 / 酶 切 缓 冲液 过 期 酶 切孵育 时间 或温度条件 错误（六） 限制性核酸内切 酶 步 骤 问题Troubleshooting - Restriction Steps10 Units 20 Units 40 UnitsIncomplete digestion due to low enzyme concentration results in ghost bands. By increasing enzyme concentration to 40 units complete digestion was achieved. Ghost bandsFor Internal Bio-Rad use ONLY!10 Units 20 Units 40 UnitsIncomplete digestion due to low enzyme concentration results in ghost bands. By increasing enzyme concentration to 40 units complete digestion was achieved. Ghost bands建 议 : 多用 TE 洗 2 次 小胶块 确保体系中加入足够的酶 - 增加酶单位 确认 DNA 浓度没有过高，从第一步减少菌体液开始，或者切小点、薄点的小胶块（六） 限制性核酸内切 酶 步 骤 问题Troubleshooting - Restriction StepsComplete Digestion 建 议 : (continued): 配置酶切预混液的内切酶和缓冲液必须高质量 -注意保存条件，不能使用过期的For Internal Bio-Rad use ONLY!酶 孵育 时间过长 (过 夜），就出 现 了 “星 晕 状 -Star Activity ）现 象；同 样 的 酶 （Ascl)反 应 2小 时 ，则 没有* Barany, F. (1988) Gene 68, 149AscI ApaIAscI ApaISame plugs re-testedovernight incubation2 hour incubation（六） 限制性核酸内切 酶 步 骤 问题Troubleshooting - Restriction StepsFor Internal Bio-Rad use ONLY!E. coli O26, BlnI其它 酶 切 问题 : 有些菌株 DNA 无法被 酶 切， 是因 为 它没有特异性 酶 识别 位点或无法接触特异性位点没接触 。 这 种 现 象往往是看到在凝胶上端（靠近梳孔） 聚集着 DNA 样 品，而泳道中既无条 带 ，也没拖尾建 议 : 用同 样 的 酶 消化另一胶 块 ，确 认 并不是先前的那 块 有 问题 ，（如先前 实验时 忘 记 加入 酶 ， 或没有接触到 酶 反 应 液 如果仍然看到如此 现 象 时 ，可以帮助确定 该酶 与菌株的适用性 问题For E.coli O26 single band was confirmed to be a valid pattern（六） 限制性核酸内切 酶 步 骤 问题Troubleshooting - Restriction StepsFor Internal Bio-Rad use ONLY!SfiI NotILanes 2 4, 6 and 7 are smears caused by expired enzyme that did not cut DNA. The same plugs cut with NotI enzyme yielded distinct bands, indicating that the plugs were fine and smears were due to using expired enzyme.S = standard提示 : 如何判断不完全 酶 切是由于 酶 或 buffer 质 量造成的 ？ 采用另一种 酶 （以前 实验 成功 验证过 ）或同 样 品种但不同批次的 酶 ， 对 同批 样 品 进 行 酶 切 测试 加入 牛血清白蛋白 (BSA) ，即使 该 酶 的供 应 没有提及。因 为 在 酶 切 过 程中既能 够 帮助 酶 保持 稳定，又能 够 减少由于抑制 剂 存在造成 酶 失活和防止 酶 粘附在管壁上的活性（六） 限制性 核酸内切 酶 步 骤 问题Troubleshooting - Restriction StepsFor Internal Bio-Rad use ONLY!Without