植物学rnai技术在植物功能基因组学中的研究进展

LOGORNAi技术在植物功能基因组学中的研究进展LOGOInterdactionvRNA干涉 (RNA interference,简称 RNAi)是指一些小的双链 RNA(double strand RNA, dsRNA)可以高效、特异的阻断体内特定基因表达 ,促使 mRNA降解 ,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。vRNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术。 可以快速分析靶基因的功能，近年来发展迅速 ,已成为功能基因组研究和反向遗传学研究的有力工具。 RNAi技术被 Science 杂志评为 2002年度的十大科技突破。LOGORNAi技术概述RNAi引起基因沉默的途径植物 RNAi表达载体的构建RNAi技术在植物上的应用RNAi存在问题与展望Text 1Text 2Text 3Text 4Text 5ContentsLOGORNAi技术概述1.1 RNAi的发现1.2 RNAi的分子机制1.3 RNAi作用的特点LOGO1.1 RNAi的发现v 1995年 ,康乃尔大学的 Guo和 Kempheus利用反义 RNA(antisense RNA)技术特异性地阻断线虫 (C.elegans)中的 par-1基因的表达以期得到与对照组注射正义 RNA (sense RNA)相反的结果，但结果却令他们费解：二者同样阻断了 par-1基因的表达途径。 v 1998年 ,Fire和 Mello等首次将正义链和反义链的混合物注入秀丽新小杆线虫 ,结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默 (gene silencing)。他们将这种现象称为 RNA干扰(RNA interference,RNAi)。 LOGO1.2 RNAi的分子机制v 外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内 ,产生一些 dsRNA。胞质中的 核酸内切酶 Dicer将这些 dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的 短双链RNA(大约 2125 bp),即siRNA。v siRNA在 RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链 ,然后反义 siRNA再与体内一些酶结合形成 RNA诱导的沉默复合物(RISC)。v RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合 ,RISC具有核酸酶的功能 ,在结合部位切割 mRNA, 被切割后的断裂 mRNA随即降解。LOGORNAi信号的放大v siRNA不仅能引导 RISC切割同源单链 mRNA,而且可作为引物与靶 RNA结合并在 依赖 RNA的 RNA聚合酶 (RNdependent RNA polymerase,RdRP)作用下合成更多新的 dsRNA,新合成的dsRNA再由 Dicer切割产生大量的次级 siRNA,从而使 RNAi的作用进一步放大 ,最终将靶 mRNA完全降解。这是一种类似于 RNA聚合酶的链式反应，该反应以 siRNA中的一条链为引物，以靶 mRNA为模板，在 RdRP作用下扩增靶mRNA，产生新的二级siRNAs(单链的具有明显极性的反义 RNA)。在 Dicer酶的作用下，这些二级siRNAs又能反作用于靶mRNA，使其降解，产生更多的 siRNAs。LOGO1.3 RNAi作用的特点v 高效性 研究发现 RNAi过程中不同浓度的 dsRNA产生的效果一样。 Miki等研究水稻 OsRac基因家族的功能时 ,通过构建单一基因片段的植物表达载体 ,成功地抑制了 OsRac基因家族的多个基因。说明 RNAi可实现在一个个体或一个细胞内同时沉默多个基因 。v 高度特异性 由 dsRNA诱导的 RNAi只引起与 dsRNA同源的 mRNA降解 ,不影响其它基因的表达 ,具有很高的特异性。 siRNA具有特征性的结构 :5末端为磷酸基 ,3末端为羟基 ,并且有 2个突出的单链核苷酸。 这种结构对 RNAi是十分必要的。vATP依赖性 研究发现 ,如果除去或降低内源性 ATP含量 ,dsRNA对靶基因的抑制作用明显降低或消失 ,加入外源性 ATP后 ,抑制作用仍未加强。说明 RNAi是一个对ATP依赖的过程 ,且外源性 ATP对此无促进作用 。 v 可传播性在植物中 ,RNAi信号可以通过胞间连丝或维管组织在细胞间传递 ;而在动物中 ,RNAi信号的扩散需要特殊蛋白参与 ,在膜上形成跨膜通道而传播到整个机体。v 可遗传性 RNAi效应可以稳定的遗传给子代 ,在子代的表现型呈孟德尔遗传方式 。 LOGORNAi技术概述RNAi引起基因沉默的途径植物 RNAi表达载体的构建RNAi技术在植物上的应用RNAi存在问题与展望Text 1Text 2Text 3Text 4Text 5ContentsLOGO转录后基因沉默（ PTGS）转录水平基因沉默（ TGS）翻译水平上基因沉默（ miRNA）RNAi引起基因沉默的途径LOGOv转录后基因沉默（ PTGS）转录后基因沉默是最普遍的一种沉默机制。PTGS通过降解 mRNA来抑制基因的表达。包括几种现象 :一种现象是植物中的 共抑制 (co-suppress)现象 ,即引起外源基因和靶基因或内源基因同时发生沉默 ,首次在矮牵牛中发现此现象。此外病毒侵染植物引起基因沉默也属于共抑制现象。另一种是真菌发生 静息现象 (quelling)。v转录水平基因沉默（ TGS）它是由 siRNA指导染色体发生变化 (包括 DNA和组蛋白甲基化 )是指启动子序列发生甲基化或局部染色体发生变化 ,影响转录因子的结合 ,使基因不能正常转录 ,下调基因表达。 LOGOv翻译水平上基因沉默这个过程主要是由内源性 miRNA介导的一种基因沉默。 miRNA的前体 (pre-miRNA)是 70 nt的茎环RNA或双链 RNA,它们在 Dicer酶、 ATP和解旋酶的共同作用下分裂成 2125 bp的成熟 miRNA。 成熟的miRNA是具有约 22 nt的 5为单磷酸基、 3为羟基的单链 RNA。 miRNA与相关蛋白质结合成另一种 RISC复合体 ,RISC复合体通过和靶 mRNA结合 ,从而导致mRNA的降解或抑制基因的转录。 植物 miRNAs明显特征是剪切靶 mRNA,如miR172,主要功能是作为翻译抑制子。LOGORNAi技术概述RNAi引起基因沉默的途径植物 RNAi表达载体的构建RNAi技术在植物上的应用RNAi存在问题与展望Text 1Text 2Text 3Text 4Text 5ContentsLOGO3 植物 RNAi表达载体的构建v3.1转基因 RNAi载体构建的关键因素在强组成型启动子下游插入反向重复片段的重组双元载体是导致 RNA沉默的基本结构。在该载体中 ,目标基因的 cDNA片段被克隆在间隔序列 (spacer)的两端,这些片段通过头头相连或尾尾相连导致该转基因产生自我互补的 hpRNA(分子内 dsRNA)结构。 LOGO内含子有无在转录时通过拼接产生功能性间隔 (spacer)内含子在介导基因沉默比无功能性的内含子更有效。 形成带有内含子的 ihpRNA载体，其沉默效率比 hpRNA高达 90%以上。启动子强弱启动子强弱对于外源基因的表达水平有重要的影响。 CaMV 35S启动子已广泛应用于双子叶植物中 ,但在水稻、小麦等禾本科植物中可用泛素 Ubiquitin启动子等 ,以提高载体的干扰程度 。目的片段大小目的片段大小的选择也十分重要。 Helliwell和 Waterhouse在构建载体时选择 50 bp1 kb的目的片段都成功地导致了目的基因沉默。但是发现较短的片段效率较低 ,较长的发夹结构在寄主细菌中容易重组。 Helliwell建议采用 300 bp600 bp大小的片段更容易获得比较有效的基因沉默。 LOGO3.2 RNAi载体构建的过程v3.2.1目的片段的克隆以植株的 DNA为模板 ,用带特定酶切位点的引物进行PCR扩增 ,然后将 PCR产物克隆到 T载体上v3.2.2 表达载体的构建正义基因片段和纯化的质粒片段连接带有正义基因片段的质粒载体与反义片段连接双元表达载体 LOGORNAi技术概述RNAi引起基因沉默的途径植物 RNAi表达载体的构建RNAi技术在植物上的应用RNAi存在问题与展望Text 1Text 2Text 3Text 4Text 5ContentsLOGO4 RNAi技术在植物上的应用4.4 植物品种改良中的应用4.3 植物雄性不育的研究4.2 植物抗病性的研究4.1 植物基因功能的研究LOGO4.1 植物基因功能的研究vChuang等在花发育研究中采用 RNAi技术进一步验证了AG,CLV3,AP1,PAN等已知功能基因 ,并开创了 RNAi技术在植物功能基因组学中的应用。 Fig. 1. Gene constructs used to analyze dsRNA effects.LOGOFig. 2. Flowers of wild-type, ag-1 and AG (RNAi) plants.Fig. 4. Effects of AG dsRNA on levels of AG mRNA and AG proteinFig. 3. Phenotypes of wild-type, CLV3 (RNAi), and clv32 plants.Fig. 5. Effects of PANdsRNA on crc-1 transgenic plants. (AandD) crc-1.34 52LOGORNAi在基因家族方面的研究v Miki等 (2005)等将水稻 OsRac基因家族的 7个成员通过 RNAi技术分别被特异抑制 ,把基因家族成员的 3-非转译区 (3-UTR)作为反向重复序列构建 RNAi载体 ,其中 3个成员被高效抑制。v 同时将 OsRac基因家族中高保守性强的序列构建 RNAi载体 ,结果不同效率地抑制了所有成员基因的表达。这个结果显示 RNAi技术在研究基因家族的有效性。LOGORNAi技术研究多倍体植物功能缺失v 研究表明 ,在真菌、动物和植物中的 RNAi是生物抵御病毒侵染的一种古老的生理机制。 vRichard等在四倍体植株中成功地运用了 RNAi技术。用拟南芥着丝点甲基化相关的 dsRNA对拟南芥的四倍体进行 RNA干扰 ,发现拟南芥的四倍体中对应的着丝点脱甲基化 ,拟南芥四倍体中对应的与甲基化有关的mRNA含量水平剧减。v 最近 ,Travella等在构建的 PDS-RNAi和 EIN1 -RNAi的六倍体小麦转基因作物中 ,成功的抑制了目的基因。研究证明 ,RNAi技术是研究多倍体植物功能缺失突变很好的工具。 LOGO4.2植物抗病性的研究v1998年 ,首次报道 RNAi技术在防治马铃薯 Y病毒抗病的应用 ,利用马铃薯 Y病毒 (PVY)蛋白酶基因片段构建 IRS载体进行烟草转化 ,使植株完全免疫。 v 根癌土壤杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)引起的根癌病危害着许多多年生水果、坚果和观赏性植物。研究发现 iaaM和 ipt2个基因在这个疾病中起重要作用。采用 RNAi技术 ,在拟南芥和番茄中沉默 iaaM和 ipt2个基因成功地抵抗了根癌病 。 LOGO4.3植物雄性不育的研究刘乐承等人采用 RNAi技术下调了白菜 BcMF4基因的表达，导致了菜心转基因植株部分花粉的不育，证明 BcMF4基因在普通白菜和菜心等白菜植物的花粉发育中起着重要作用 .Cigan等利用 RNAi技术直接沉默玉米的花粉囊基因表达的启动子 MS45,从而抑制花粉囊的形成 ,形成玉米的雄性不育株 ; 利用不同的启动子使已经沉默的启动子 MS45重新表达 ,玉米植株重新恢复育性。 LOGO4.4植物品种改良中的应用v 日本生物技术研究所使用 RNA干扰花色素苷和类黄酮生物合成的关键酶查耳酮合成酶 (CHS)基因 ,成功地将花由原先的蓝色转变为白色和粉色 ,创造了新的商品花卉。v Ogita等利用 RNAi抑制咖啡因合成酶 (theobromine synthase)基因的表达 ,结果咖啡因含量降低了 57成。v Liu(2002)等利用 RNAi技术对棉籽油的成分进行改良 , 应用 RNAi技术下调两个主要脂肪酸脱氢酶基因的表达 ,从而将棉籽油中的高油酸和高硬脂含量水平降低 .v 利用 RNAi通过敲除 22kD玉米贮藏蛋白的表达，培育出高赖氨酸玉米品种 (segaletal.， 2003)。v Ganga等 (2005)采用果实特异启动子结合 RNAi技术来抑制番茄内源光形态建成调节基因 DET1的表达 ,结果类胡萝卜素和类黄