05生物制品的佐剂保护剂灭活剂

免疫佐剂、保护剂和灭活剂 三类重要的生物制品原料免疫佐剂 一、佐剂概述 二、不溶性盐类胶体佐剂 三、油乳佐剂 u佐剂的概念u基本要求u佐剂的分类u作用机理佐 剂 概述u佐剂的概念单独使用时一般没有免疫原性，与抗原物质合并使用时，能增强抗原物质的免度原性，增强机体的免疫应答，或者改变机体免疫应答类型的物质，称为佐剂（ adjuvant），也称免疫佐剂（ immune adjuvant）或抗原佐剂（ antigen adjuvant）。广义的讲，凡是可以增强抗原特异性免疫应答的物质均可称为佐剂。u对佐剂的基本要求 因为几乎所有畜禽及其产品都是 直接或间接 人类食品，所以佐剂作为一些生物制品的成分，必须考虑其 安全性和副作用 ，既要考虑对动物的安全性，也必须考虑对人的安全性。世界卫生组织及一些专家认为：生物制品的佐剂，在考虑其免疫增强效应的同时，必须具有以下条件必须具有以下条件l 无致癌性 ，也不应是辅助致癌物质，不能促进肿瘤的形成；l 无毒性 ，肌肉或皮下注射均安全；l 化学纯 ；l 吸附力强 ；l 易于吸收 ；l 不 含有与人体或动物体有 交叉反应 的抗原物质；l 佐剂 不 应引起对其本身的 超敏感性 ，也不应与血清抗体结合而形成有害的免疫复合物；l 佐剂疫苗经 1-2年保存应当 稳定 不变质，效力无明显改变， 不 引起任何 不良反 应。u佐剂的分类目前尚无一致的公认合理的分类方法，从不同角度可作如下分类： 根据佐剂的性质分类 (1) 微生物及其组分微生物微生物如有结核杆菌、卡介苗、短小棒状杆菌、沙门氏菌、乳杆菌、双岐杆菌、葡萄球菌、链球菌、副粘病毒及细小病毒等。微生物组分：如有 分枝杆菌 细胞壁的胞壁酰二肽、乳酸菌及粪链球菌的细胞壁肽聚精、短小榨状杆菌的细胞壁骨架成分、耻垢分枝杆菌等提取的水溶性佐剂、分枝杆菌提取的高分子多肽糖酯 (即腊质 I)、革兰氏阴性菌的脂多糖、肺炎杆菌的糖蛋白、酵母菌提取的酵母多糖及香菇的香菇多糖等。 (2) 非微生物物质 A. 高分子物质 例如 DNA、 RNA、聚丙烯酸、聚乙烯吡啶烷酮。B. 低分子物质 例如硫酸铝、氢氧化铝、磷酸钙、钾明矾等。C. 油类 包括矿物油 (如白油 )、植物油 (如花生油 )等。D. 药物类 例如吡喃、丙胺肌苷、左旋嘧啶等。E. 中草药类 如冬虫夏草、天麻、黄芪、苦参等也有佐剂作用。F. 表面活性剂 能降低液体表面张力的物质，包括： 阴离子表面活性剂，如硬酯酸铝、单硬酯酸甘油酯等； 阳离于表面活性剂，如十二烷基三甲基溴化铵、十六烷基三甲基溴化铵、十八烷基酪氨酸盐酸盐等； 非离子性表面沽性剂，如 Span-80、 Span-85、 Tween-80等。 根据佐剂在体内存留时间分类 (1) 贮存型佐剂（ depot type adjuvant）佐剂与抗原混合成悬浊状态，使其尽可能存留于注射局部较长时间，以使抗原缓慢地释放，持续刺激机体免疫系统，使之产生较强免疫应答。 (2) 非贮存型佐剂（ non-depot type adjuvant）多属细胞毒性物质，又称为细胞毒型佐剂 (cytotoxic type adjuvant)。这类佐剂不同抗原混合，两者在相互隔开的部位分别注射也可出现效果。非贮存型佐剂又可分为生物佐剂和非生物佐剂两类 。类 型 佐 剂贮存型不溶性胶体佐 剂 ： Al(OH)3、 AlPO4、 Kal(SO4)212H2O、 Ca(PO4)2、炭末等油乳佐 剂 ： 弗氏完全佐 剂 、弗氏不完全佐 剂 、 Span白油佐 剂 等。非贮存型生物佐 剂结 核菌、卡介苗、乳酸杆菌、短小棒状杆菌、葡萄球菌、 链 球菌、 细 菌脂多糖、酵母多糖等非生物佐 剂表面活性 剂 ： Tween80、溶血卵磷脂 类 似物、溴化十八 烷 基三甲 铵 。胺及其 类 似物：癸胺、癸胍及其他。核酸及 类 似物： DNA、 RNA、低核苷酸、多聚核苷酸、 环 磷酸腺苷等。药 物：左旋咪 唑 及蜂胶等 u佐剂的作用机理 各种佐剂的作用机理不尽相同，但概括起来有如下方面1对抗原的作用 (1) 增加抗原分子的表面积某些佐剂颗粒表面可以吸附许多抗原，使抗原表面积明显增加，特别是可溶性抗原或半抗原，经胶体颗粒吸附后，抗原性增强，抗体滴度明显提高。 (2) 延长抗原在体内的存留时间抗原与某些佐剂混合后形成凝胶状，延长抗原在体内的贮存时间，使其徐徐释放，因而提高抗原物质的免疫原性。 2对机体的作用 u对单核巨噬细胞的作用佐剂能引起细胞浸润，出现巨噬细胞、淋巴细胞及浆细胞 聚集 ， 促进这些细胞 增殖 发挥更大作用。有些佐剂，如短小棒状杆菌、百日咳杆菌和葡聚糖等，主要作用于巨噬细胞，使之激活，大量增殖分化，释放白细胞介素 -1等 细胞因子 ，再去活化 T细胞和 B细胞。被激活的 T细胞进一步分泌各种细胞因子，进而促进 B细胞和巨噬细胞功能。 u对 T细胞的作用一些佐剂的主要作用对象是 T细胞，通过 T细胞的介导 ，增强各种免疫功能。胸腺素、分枝杆菌及其有关成分如卡介苗及 MDP等、香菇多糖、异丙肌昔、左旋咪吐、二乙胺基二硫代甲酸钠（ DTC）等均为 T细胞增强剂。它们作用于胸腺细胞系统，诱导 T细胞前体细胞的产生， T细胞大量增殖分化，形成效应淋巴细胞，产生淋巴因子。 uB细胞的作用某些佐剂可以直接作用于 B细胞，如细菌脂多糖，以 B细胞为主要靶细胞，使之多 克隆增殖 ，并诱导 B细胞对 T细胞的敏感性，从而增强对 TD抗原的免疫应答，提高抗体水平。u非特异性免疫增强作用佐剂效应，除加强抗原引起免疫应答能力以外，还能对各种感染和肿瘤具有 非特异性免疫增强 作用，主要是 加强 NK细胞和 K细胞的活性 。这种非特异性的免疫作用，至少有一部分是通过诱导干扰素生成而造成的。香菇多糖、葡聚糖、云芝多糖、果聚糖等多糖在体内都能诱生干扰素。不溶性盐类胶体佐剂 动物疫苗中的灭活苗和类毒素，需用佐剂来加强它的免疫效应，铝佐剂是最常用的佐剂之一。它们性质稳定，便于贮存，接种后只在局部产生小的肉芽肿，对肉的品质没有严重影响 。 这些佐剂的作用机理是：将佐剂与抗原混合，形成凝胶状态，注入动物体内后形成 “ 抗原贮存库 ” ，这些不溶性颗粒能吸附、分散抗原物质，增加抗原表面积，在组织中形成一个富含巨噬细胞的肉芽肿，延缓吸收。此外，铝化合物能 激活补体 ，引起过敏毒素的产生，在注射部位形成慢性炎症，并可在 记忆性 B细胞 产生过程中起促进作用，促进体液免疫。 氢氧化铝胶 氢氧化铝胶 Al(OH)3 ，简称铝胶，是常用的佐剂之一。氢氧化铝胶有如下缺点： 有轻度局部反应，可以形成肉芽肿，极个别的发生局部无菌性脓肿； 因其理化性质特点，含铝胶疫苗怕冻，冻后铝胶容易变性； 有可能对人、畜神经系统有影响； 主要诱导体液免疫，不能明显地诱导细胞介导免疫应答。氢氧化铝胶是一种具有良好吸附作用的佐剂，不仅能将可溶性抗原吸附于铝胶分子表面，又是良好的沉淀剂，可以浓缩抗原减少注苗剂量。铝胶可以自己合成，所以成本低廉使用方便最大的特点是基本无毒一直广泛用于人用和兽用疫苗的制备，是兽医生物制品生产中应用最广的一种佐剂。可刺激机体迅速产生持久的高抗体水平，也比较安全，对于胞外繁殖的细菌及寄生虫抗原是良好的疫苗佐剂。 （二）常用佐剂的种类和制备5%硫酸铝 5%氢氧化钠 氢氧化铝沉淀制成悬液即为佐剂强烈搅拌 NS洗二次NS等 体积抗原免疫接种磷酸三钙 疫苗中加磷酸三钙 【 Ca3(PO4)2】 佐剂，与铝胶一样具有吸附沉淀作用，但使用更加简便。磷酸钙佐剂的缺点是： 含盐量高； 贮存日久有结晶沉淀。 油乳佐剂 这类佐剂有油和乳化剂组成， 将一种溶液或干粉分散成细小的微粒，混悬于另一种不相溶的液体中所成的分散体系称为乳剂 。被分散的物质称为 分散相 ，承受分散的液体称为 连续相 ，这两相间的界面活性物质称为 乳化剂 。当以水为分散相，以加有乳化剂的油为连续相时，制成的乳剂为 油包水型 (W/O)，反之为水包油型 (O/W)。油包水型油乳佐剂粘稠，在机体内不易分散，抗原从乳剂中缓慢释放，佐剂活性较持久，为生物制品所采用的主要类型。水包油型油乳佐剂较稀薄，注入机体内易十分散，佐剂作用较低。 n弗氏佐剂是疫学上广泛应用的油类佐剂，由低引力和低粘度的矿物油及乳化剂组成的一种贮藏性佐剂。n有两种类型，弗氏不完全佐剂 、弗氏完全佐剂。佛氏完全佐剂是在不完全佐剂的基础上加一定量的分枝杆菌而成。 (一 ) 弗氏佐剂1弗氏不完全佐剂将 石蜡抽 与乳化剂 (如羊毛脂、 Tween-80等 )混合，用时再与抗原混合，借助乳化剂制成油包水佐剂。弗氏不完全佐剂的作用具有以下特点： 延缓蛋白抗原的吸收； 矿物油可促进抗原分散； 注射部位形成的肉芽肿。弗氏不完全佐剂一般不能诱发很强的细胞免疫，不能诱发迟发型超敏反应。在 FIA中加入杀死的分枝杆菌或者卡介苗，即为弗氏完全佐剂(FCA)。每毫升 FIA中，加入死分枝杆菌或卡介苗 2-3mg，使用时与抗原等量混合。FCA是一种强有力的佐剂，其作用机制是：特异性地刺激 T细胞的功能，增强机体对胸腺依赖性抗原的应答；它还能刺激巨噬细胞的活性，促进吞噬作用和细胞毒作用。FCA的缺点是： 它的油能通过肌膜层造成组织损伤，局部形成结形和无菌性脓肿； FCA含有分枝杆菌，使结核菌素试验呈阳性反应； 粘稠，不便使用。2弗氏完全佐剂作用大于不完全佐剂局部形成肉芽种和溃疡不能用于人体弗氏完全佐剂液体石蜡完全乳化 备用高压灭菌加热抗原弗氏不完全佐剂卡介苗羊毛脂鉴定一滴乳剂乳剂不散浮于液面水中混合(二 ) 白油 Span佐剂 用轻质矿物油 (白油 )作油相，用 Span-80(去水山梨醇单油酸酯 )或Span-85(去水山梨醇三油酸酯 )及吐温 -80(Tween-80)(聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯 )，作为乳化剂制成的油乳佐剂，是当前兽医生物制品中最常用最有效的佐剂之一。白油佐剂的配制方法很多，比例互有差别，仅举一例作为参考，即：将白油与 Span-80(比例为 94:6)混合，再加总重量 2%硬脂酸铝，溶化混匀， 116C高压灭菌 30min，即为油相。将抗原溶液与 Tween-80(96:4)混合为水相，油相与水相之比按 1:1的比例，先将油相倾入组织捣碎机或胶磨内，在低速搅拌下缓缓加入水相，然后继续加速搅拌而成油乳剂苗。此类疫苗要求白色，滴于冷水中不分散。内容提要灭活与灭活剂 一、灭活的概念 二、常用的灭活剂 三、影响灭活作用的因素 灭活的概念 这里所讲的灭活是指微生物的灭活，即 破坏微生物的生物学活性 ， 破坏 病原微生物的 繁殖能力及致病性 ，并且尽可能不影响或少影响其免疫原性，用以制备灭活疫苗 。 目前多用化学方法进行微生物的灭活，用来灭活的化学试剂或药物等称为灭活剂（ inactivator）。化学灭活剂灭活是制备灭活苗最重要的手段，化学灭活剂的灭活效能与使用剂量、灭活时间、灭活时的温度及溶液的 pH等都与灭活苗的质量密切相关。 常用的灭活剂 (一 ) 甲醛 甲醛是最古典和应用最广的灭活剂。早在 1911年， Lowenstein和Eisler用甲醛处理破伤风毒素，使之脱毒而成类毒素。 1924年 Puntoni以0.1%甲醛制成犬瘟热疫苗，甲醛为无色气体，易溶于水和乙醇，水溶液称为福尔马林，通常浓度为 36%-40%，有强烈的刺激性。长期低温或受冻保存，可以聚合而成三聚甲醛或多聚甲醛。 n甲醛的灭活作用是甲醛的醛基作用于微生物蛋白质的氨基产生羟甲基胺，作用于羧基形成亚甲基二醇单酯，作用于羟基生成羟甲基酚，作用于巯基生成硫代亚甲基二醇。n甲醛还可与 RNA碱基中的游离氨基特异性结合，且结合的活性远远大于与 DNA结合；可抑制微生物的蛋白质合成。n甲醛还可引起细菌蛋白中氨基与羟基发生分子内交联。所有这些交联使微生物结构有轻微改变，失去活性，但不明显影响其免疫原性。 甲醛的使用浓度n 一般需氧细菌用 0.1%-0.2%的浓度；n 厌氧菌则多用 0.4%-0.5%杀菌或脱毒；n 处理时间 37-39C 24h以上，有的需要更长时间。例如猪肺疫灭活苗，用 0.1%的甲醛溶液，在 37-38C条件下灭活 7-12h；气肿疽灭活苗，用 0.5%的甲醛液， 37-38C灭活 72-96h，而破伤风类毒素用 0.4%甲醛液，在 37-38C条件下灭活 21-23天。n 甲醛用于病毒灭活其浓度可在 0.05%-0.4%范围内，大部分使用 0.2%-0.3%。 注意：这里指的是甲醛的浓度，并非福尔马林的浓度！(二 ) 苯酚酚类是以羟基取代苯环上的氢而形成一类化合物。苯酚 (phenolum)，又称石炭酸 (acidum carbolicum)，为具有特殊气味的无色结晶，易潮解，溶于水及有机溶剂，见光则颜色变深，置于空气中易被氧化，颜色也变深，所以应避光保存。 酚类化合物的抗菌作用是通过损害细菌细胞膜，使胞浆漏出，并使菌体溶解；可使菌体蛋白质凝固；抑制细菌特异酶系统 (如脱氢酶和氧化酶 )活性。 苯酚在 0.2%浓度时，即可抑制一般细菌的生长，而杀菌则需要 1%以上的浓度，如杀死葡萄球菌和链球菌需要 3%的浓度作用 1-3min，芽胞和病毒对苯酚的耐受性很强。 （三）结晶紫 n结晶紫是一种碱性染料，为甲基紫的纯品；n化学名为六甲基副玫瑰苯胺；n灭活机制结晶紫 的阳离子与微生物蛋白质带阴电的羧基形成弱电离化合物，妨碍了微生物的正常代谢，扰乱微生物的氧化还原作用