第六章真菌毒素的检测ppt

第六章 真菌毒素的检测 第一节 概述 由真菌生产的有毒代谢产物统称为真菌毒素。 真菌毒素的危害： （ 1）引起粮食作物的病害和产品腐败变质； （ 2）对人类和动物健康产生威胁。真菌毒素的种类 黄曲霉素 (AF)、赭曲霉素 (OA)、单端孢酶烯族毒素、玉米赤霉烯酮 (ZEA). 真菌毒素毒性： （ 1）致 DNA损伤，有的致癌； （ 2）细胞毒性，有的破坏质膜和细胞酶的作用 第二节 真菌毒素检测中样品前处理方法 一、采样和样品的准备 采样是真菌毒素测定中一个非常重要的步骤。 1.采样的地点 根据分析目的的不同确定采样地点，如：农田、仓库、加工厂、运输工具、零售商和医院等。. 2.采样方法 （ 1）静态样品的采集 静态样品 ：麻袋、箱柜和车厢等容器存放分样品均属静态样品。 采样工具 ：顶端尖锐的长柄采样钎子。 采样数量 ： （ 1）小批量时所采麻袋数为批内麻袋数的 1/4； （ 2）大批量时为整批麻袋数开平方 （ 3）采样量远远超过分析所需量时，应将样品充分混合后，按四分法对角连续多次分样缩减导需要的量，一般， 1000kg农产品中的采样量为几百克。3.采样量 采大样，按四分发对角连续多次分样缩减至 1 2kg，最后取代表样全部粉碎。 美国农业部 USDA的方法：成批样每批取 3份大样，每份 22kg。. 4.实验室分析用样品的采样和样品准备 实验室分析用的样品为 1 5kg。二 .提取 1.提取溶剂 溶剂的选择取决于待测毒素的种类、毒素性质、毒素在提取溶剂中的溶解度、提取溶剂的毒性价格、非测定成分在提取溶剂中的分配系数等。 选用：毒性小、极性大、价格低廉的溶剂系统 常用溶剂： 甲醇、氯仿、丙酮、己烷、乙酸乙酯、乙睛和水中一种或多种不同配比的混合物。2.提取温度 温度影响毒素的回收率。适当升高温度可以增加毒素的回收率。3.食品基质 固体食品：选用浸剂、洗脱、索氏回流等方法。 液体食品：液液分配方法。 提取酸性真菌毒素时，通常需提高提取溶剂系统中水相的 PH值，使其有效地将被提取物碱化或形成水溶性碱混合物后，再进行提取。三 .纯化 纯化：在确保不损失待测毒素的前提下除去干扰杂质，过程称为纯化。 常用净化方法： 液固萃取、液液分配、化学吸附、色谱法、透析法以及 SFE法等。 使用最广泛的是色谱法。. 色谱法： 薄层色谱法（柱色谱法最常用） 吸附色谱柱常用的吸附剂： 硅胶、矾土、氧化铝、活性炭、弗罗里硅土 分配色谱柱常用的填充剂：硅藻土、纤维素。 固相提取（广泛采用） 免疫亲和柱 IAC（应用于农产品的新技术）第三节 真菌毒素的仪器分析 一 .薄层色谱法（ TLC): 1.原理 样品经提取、净化、薄层分离后，某些真菌毒素在紫外光下，产生特定的荧光，以标准品作参比，根据其在薄层上显示的荧光的最低检出量来定量。适用于本身能够产生荧光的真菌毒素。 如： AFB 、 OTA 优点：经济、对设备和检验人员要求不高。二 .高效液相色谱法（ HPLC） 原理 ：样品中的真菌毒素经柱层析分离后，通过测量色谱峰的面积定量。 优点： 特异性强、灵敏度高、定量准确。 分析时应考虑流动相、色谱柱、柱温和检测器等分析条件，找出最佳配比。 有荧光的用荧光检测器 B类单端孢霉烯族化合物本身不产生荧光，但 C6位置上有酮基，虽不能用 HPLC配荧光检测器，但可配紫外检测器检测。3.应用 选用液相色谱荧光分光光度法是定量测定农产品中玉米赤霉烯酮污染最可靠、亦是最常用的方法。. （ 1）玉米赤霉烯酮的测定 样品的提取 用甲醇、乙醇、水混合液提取，提取液经液液分配萃取，硅镁吸附剂柱层析纯化后，供液相色谱法检测。. 色谱条件： 液相色谱柱： 125mm4.6mm（内径），不锈钢制，内填 5umODS，操作时柱前串联安装 40mm4.6mm内径、填料20umODS的保护柱，用反向柱 ODS分离，流动相为甲醇或甲醇与水混合液。. 测定方法 收集上述样品提取液，用旋转蒸发仪在 40度下挥发掉有机溶剂，用甲醇定容至一固定体积，取适量提取液注入到液相色谱仪中，通过工作站得到检测值。 流动相 :甲醇、水混合液提取 ,流速 0.6mL/min,荧光分光光度检测器 波长： 276nm，发射波长： 460nm，检测波长：236nm 测定结果。. （ 2）伏马菌素的测定 由于伏马菌素的极性较大，一般采用强极性溶剂萃取，然后用固体吸附剂去除杂质，将洗脱剂蒸干后，用甲醇溶解残渣供分析用。. 色谱条件 流动相：乙睛水三氯乙酸（ 5： 95：0.025） C18柱为分离柱 波长： 230nm直接进行紫外检测，乙睛水（ 80： 20）为流动相，流速 1mL/min，进样量 5uL。 测定结果三 .气相色谱法（ GC） 1.研究进展 单端孢菌毒素的 GC分析方法得到广泛应用。 主要用于分析分子中不含发色集团和荧光基团，或具有弱荧光或弱吸收的真菌毒素。. 2.应用 （ 1）赭曲霉素的 GC测定 赭曲霉毒素 A首先被转化成邻甲基赭曲霉毒素 A甲醚衍生物，然后用毛细管 GCNICI-MS进行鉴定，定量分析时，要使用多离子检测和六氘化赭曲霉毒素 A甲醚作为内标， MS电离方法是负离子化学电离。. （ 2） GC（电子捕获器）测定 10种单端孢霉烯族毒素。 （ 3） GC测定 A类单端孢霉烯族真菌毒素的所有方法比较四 .免疫化学分析法 免疫反应： 就是指抗原和抗体分子的结合，这种结合形式可以是游离的，也可以结合在细胞表面，抗原抗体复合物的形成要求二者分子结构有互补性、抗原与抗体的结合也因此具有高度特异性。 优点： 高度特异性、高灵敏度、快速简便等。 可以在组织、细胞和生物分子等上应用。. .免疫化学分析方法放射免疫检测法酶联免疫吸附法（ ELISA）. 1.放射免疫检测 标准品经同位素标记后与样品混合，加入定量特异性抗体后对抗原抗体复合物的放射性计数，根据结果计算样品种的抗原浓度，复合物的放射性强度与样品种的抗原浓度成正比。 优点：特异性强、灵敏度高 缺点：使用放射性标准品、有放射性污染，标准试剂寿命短，必须与液体闪烁计数器等昂贵仪器联合使用，不便在基层推广。. 2.酶联免疫吸附法 优点：灵敏、操作简便、样品前处理无需净化。. （ 1）酶联免疫吸附法检测真菌毒素的技术要点： 第一，抗原（抗体）能结合到固相载体的表面并保持免疫活性； 第二，抗体（抗原）与酶结合所形成的结合仍然保持