引物设计及相关软件使用38057ppt课件

PCR引物设计及相关软件使引物设计及相关软件使用用主要内容主要内容n 背景背景n PCR引物设计原则引物设计原则n 常用常用 PCR引物设计软件引物设计软件n Oligo 7.0 介绍介绍PCR聚合酶链反应聚合酶链反应 (Polymerase Chain Reaction ,PCR)是是 80年代中期发展起来的体外核酸扩年代中期发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、简便、重复性好、易自动化等突出优点；、简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究的目的基因或某能在一个试管内将所要研究的目的基因或某一一 DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍倍 ,使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛使肉眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的发、一滴血、甚至一个细胞中扩增出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。供分析研究和检测鉴定。 PCR引物设计引物设计n 引物设计是引物设计是 PCR 技术中至关重要的一技术中至关重要的一环。使用不合适的环。使用不合适的 PCR 引物容易导致引物容易导致实验失败：表现为扩增出目的带之外实验失败：表现为扩增出目的带之外的多条带（如形成引物二聚体带），的多条带（如形成引物二聚体带），不出带或出带很弱，等等。现在不出带或出带很弱，等等。现在 PCR 引物设计大都通过计算机软件进行。引物设计大都通过计算机软件进行。可以直接提交模板序列到特定网页，可以直接提交模板序列到特定网页，得到设计好的引物，也可以在本地计得到设计好的引物，也可以在本地计算机上运行引物设计专业软件。算机上运行引物设计专业软件。引物设计的原则引物设计的原则n 引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补n 引物与引物之间避免形成稳定的二聚引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构体或发夹结构n 引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发 DNA 聚合反应聚合反应 (即错配即错配 )。 n 如引物长度（如引物长度（ primer length），产物长度），产物长度（ product length），序列），序列 Tm 值值 (melting temperature)，引物与模板形成双链的内部，引物与模板形成双链的内部稳定性稳定性 (internal stability, 用用 G 值反映值反映)，形成引物二聚体，形成引物二聚体 (primer dimer)及发夹及发夹结构（结构（ duplex formation and hairpin）的）的能值，在错配位点（能值，在错配位点（ false priming site）的引发效率，引物及产物的的引发效率，引物及产物的 GC 含量（含量（composition），等等。必要时还需对引物），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。突变等。具体因素具体因素一般原则一般原则n 1.引物长度引物长度n 引物的长度一般为引物的长度一般为 15-30 bp，常用的是，常用的是 18-24 bp，但不应大于，但不应大于 38，因为过长会导致其延伸温度大，因为过长会导致其延伸温度大于于 74 ，不适于，不适于 Taq DNA聚合酶进行反应聚合酶进行反应 。 引物引物过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度过短又同时会引起错配现象，一般来说引物长度大于大于 16bp是必要的（不容易引起错配）。是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为例如：一个长度为 12bp的引物在人类基因组上存在的引物在人类基因组上存在 200个潜在的退火位点个潜在的退火位点 (3 x 109/412=200 ).而一个长度为而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位点只有的引物在人基因组上存在的退火位点只有1/400个个 .n Tm值的计算值的计算n 一般的公式一般的公式n Tm = 4 (G+C) + 2(A+T) n 对于长一些的引物可用更为准确的对于长一些的引物可用更为准确的n nearest-neighbor （ Frier et al. (1986) ）一般原则一般原则2. 引物序列在模板内应当没有相似性较引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是高，尤其是 3端相似性较高的序列，端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物否则容易导致错配。引物 3端出现端出现 3 个以上的连续碱基，如个以上的连续碱基，如 GGG 或或 CCC，也会使错误引发机率增加。也会使错误引发机率增加。 一般原则一般原则3，引物，引物 3端的末位碱基对端的末位碱基对 Taq 酶的酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为，末位碱基为 A 的错配效率明显高于的错配效率明显高于其他其他 3 个碱基，因此应当避免在引物个碱基，因此应当避免在引物的的 3端使用碱基端使用碱基 A。另外，引物二聚体。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致或发夹结构也可能导致 PCR 反应失败反应失败。 5端序列对端序列对 PCR 影响不太大，因此影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。常用来引进修饰位点或标记物。一般原则一般原则4. 引物序列的引物序列的 GC 含量一般为含量一般为 40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的游引物的 GC含量不能相差太大。含量不能相差太大。不同的算法推荐不同的算法推荐 45-55%或或 50-60%一般原则一般原则5. G 值是指值是指 DNA 双链形成所需的自由双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用的相对稳定性。应当选用 3端端 G 值值较低（绝对值不超过较低（绝对值不超过 9），而），而 5端和中端和中间间 G 值相对较高的引物。引物的值相对较高的引物。引物的 3端的端的 G 值过高，容易在错配位点形值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发成双链结构并引发 DNA 聚合反应。（聚合反应。（能值越高越容易结合）能值越高越容易结合） 一般原则一般原则6. 对引物的修饰一般是在对引物的修饰一般是在 5端增加酶切端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。产物的载体的相应序列而确定。 一般原则一般原则7. 引物二级结构对引物二级结构对 PCR反应的影响。反应的影响。尽可能少的引物二聚体。尽可能少的引物二聚体。 一对理想的引物应当不存在任何一种上述结构。 值得一提的是，各种模板的引物设计难度不一。有的模板本身条件比较困难，例如GC含量偏高或偏低，导致找不到各种指标都十分合适的引物；在用作克隆目的的 PCR因为产物序列相对固定，引物设计的选择自由度较低。在这种情况只能退而求其次，尽量去满足条件。 下面我们以克隆目的基因 APP751 (aa18-285)为例，简单介绍一下使用 oligo 7.0如何设计产物序列固定的引物！ Oligo 7 使用说明使用说明主要功能：专门的引物设计软件主要功能：专门的引物设计软件“Oligo”的功能比的功能比 “Premier”还要单一，就还要单一，就是引物设计。它的引物分析功能如此是引物设计。它的引物分析功能如此强大以至于能风靡全世界。强大以至于能风靡全世界。 Oligo 7.0 启动界面启动界面Open sequence file用用 Oligo 设计引物时的设计引物时的 3个标准个标准n Tm 值曲线以选取值曲线以选取 5到到 3的下降形状有的下降形状有利于引物引发聚合反应。利于引物引发聚合反应。n Frq 曲线宜选用曲线宜选用 3端端 Frq 值相对较低的值相对较低的片段。片段。n G 值在值在 5端和中间值比较高，而在端和中间值比较高，而在 3端相对低端相对低选择上游引物选择上游引物上游引物Select Forward Primer选择下游引物选择下游引物Select Reverse Primer下游引物引物参数引物参数引物参数引物详细参数引物详细参数Key information of primerDimer and cross DimerHairpinGC%Total PCR information引物分析引物分析n 首先检查引物二聚体尤其是首先检查引物二聚体尤其是 3端二聚体端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身二聚体有可能是上游或下游引物自身形成，也有可能是在上下游引物之间形成，也有可能是在上下游引物之间形成（形成（ cross dimer）。二聚体形成的能）。二聚体形成的能值越高，越不符合要求。一般的检测值越高，越不符合要求。一般的检测（非克隆）性（非克隆）性 PCR，对引物位置、产物，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。形成二聚体或其能值较低的引物。引物分析引物分析n 第二项检查是发夹结构（第二项检查是发夹结构（ hairpin）；与）；与二聚体相同，发夹结构的能值越低越二聚体相同，发夹结构的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以好。一般来说，这两项结构的能值以不超过不超过 4.5为好。当然，在设计克隆目为好。当然，在设计克隆目的的的的 PCR引物时，引物两端一般都添加引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种能值不会太低。这种 PCR需要通过灵活需要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高物的发夹结构的检测就不应要求太高。引物分析引物分析n 第三项检查为第三项检查为 GC含量，以含量，以 45-55为宜。有一些模为宜。有一些模板本身的板本身的 GC含量偏低或偏高，导致引物的含量偏低或偏高，导致引物的 GC含量含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游引物的物的 GC含量以及含量以及 Tm值保持接近，以有利于退火温值保持接近，以有利于退火温度的选择。如果度的选择。如果 PCR的模板不是基因组的模板不是基因组 DNA，而是，而是一个特定模板序列，那么最好还进行一个特定模板序列，那么最好还进行 False priming site的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引的检测。这项检查可以看出引物在非目的位点引发发 PCR反应的可能性。如果引物在错配位点的引发反应的可能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的效率比较高，就可能出假阳性的 PCR结果。一般在结果。一般在错配引发效率以不超过错配引发效率以不超过 100为好，但对于特定的模板为好，但对于特定的模板序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如序列，还应结合比较其在正确位点的引发效率。如果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为 450以上，而在错误位点的引发效率为以上，而在错误位点的引发效率为 130，那么这对引，那么这对引物也是可以接受的。物也是可以接受的。 Final PCR informationPCR产物n 当我们结束以上四项检测，点击当我们结束以上四项检测，点击 PCR产产物，其中总结性地显示该引物的位置物，其中总结性地显示该引物