生物化学实验碱性磷酸酶的分离提取及比活力的

实验 碱性磷酸酶的分离提取及比活力的测定n 目的要求：1.学习蛋白质分离纯化的一般原理和步骤2.掌握碱性磷酸酶制备的操作技术及比活测定的方法1.原理n 碱性磷酸酶 (Alkaline phosphatase EC 3.1.3.1 简称为 ALPase) 广泛存在于微生物界和动物界。 ALPase能催化几乎所有的磷酸单酯的水解反应，产生无机磷酸和相应的醇、酚或糖。它也可以催化磷酸基团的转移反应，磷酸基团从磷酸酯转移到醇、酚或糖等磷酸受体上。n n 在蛋白质或酶的分离提取过程中由于酶蛋白容易变性而失活，为了获得较好的分离提取效果，在工作中特别注意以下几点：n 取用新鲜的材料，提取工作应在获得材料后立刻开始，否则应在低温下保存。选择来源丰富，酶含量高的材料。n 用盐分级沉淀是一种应用非常广泛的方法。由于硫酸铵在水中溶解度很大（ 20 ，每升可溶 760克），并且对许多酶没有很大的影响，因此它是最常用的盐。n 在酶的制备过程中，每经一步处理，都需测定酶的活力和比活力。唯有比活力提高较大，提纯步骤才有效。n 酶活力的分析：通常是以对 -硝基苯磷酸二钠（pNPP） 为底物，在 pH10.1的碳酸盐缓冲液（含 2 mmol/L Mg2+） 的测活体系中检测酶催化 pNPP水解产生黄色的对硝基苯酚（ pNP） 的量。产物pNP在 405 nm处有最大的吸收峰，可以根据OD405 nm 值的增加计算酶活力的大小。n 酶活力定义为：在 37 下，以 2 mmol/L pNPP为底物，在 pH10.1的碳酸盐缓冲液含 2 mmol/L Mg2+的测活体系中每分钟催化产生 1 mol/L pNP的酶量定为 1个酶活力单位。酶的比活力定义为每 mg蛋白所具有的酶活力单位数。n 蛋白质浓度的测定常采用福林 -酚试剂（ Folin-Phenol reagent） 显色法 n 操作方法3.1 牡蛎碱性磷酸酶的分离提取n 每组称取 20 g牡蛎（蒸馏水洗净），加入 50 mL预先冷却的 0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（ pH 7.5，含 0.1 mol/L NaCl）， （ 两组一起） 于高速组织捣粹机匀浆 1 min， 于冰箱 4 放置 1 h进行抽提。n 室温离心， 3000 r/m 20 min， 收集离心上清液，（两组分开） 并量体积。（留 2 mL上清液，待测酶的比活力。） n 在上清液中加入研磨细粉的固体硫酸铵至 0.35饱和度（ 100 mL加入 20.9 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置 1 h。n 室温离心， 3000 r/m 20 min， 收集离心上清液，并量体积。（留 2 mL上清液，对 0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液 pH 7.5含 0.1 mol/L NaCl 透析平衡，待测酶的比活力。） (5) 0.35饱和硫酸铵上清液，加入固体研磨细粉的硫酸铵至 0.70饱和度（ 100 mL加入 23.8 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置 2 h。(6)室温离心， 4000 r/m 20 min， 收集沉淀物。 (7) 得到沉淀物，溶于 5 mL含 0.1 mol/L NaCl 的 0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。 装入透析袋，对 0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无 SO42-被检测出为止（可用一定浓度 BaCl2溶液检验）。(8) 取出酶溶液，冷冻高速离心（ 0 25000 r/m 30 min）。(9) 离心上清液即为粗酶制剂，检测酶的比活力。装入棕色瓶于 4 冰箱保存。20 g牡蛎牡蛎 加入加入 50 mL预先冷却的预先冷却的 0.01 mol/L Tris-HCl 缓冲液（缓冲液（ pH 7.5，含含 0.1 mol/L NaCl），）， 于高速组织捣粹机匀浆于高速组织捣粹机匀浆 1 min， 于冰箱于冰箱4 放置放置 1 h进行抽提。进行抽提。室温离心，室温离心， 4000 r/m 20 min， 收集离心上清液，并量体积收集离心上清液，并量体积。匀浆液上清液缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至缓慢加入研磨细粉的固体硫酸铵至 0.35饱和度（饱和度（ 100 mL加入加入 20.9 g），）， 不断搅拌溶解，置冰箱静置不断搅拌溶解，置冰箱静置 1 h。室温离心，室温离心， 4000 r/m 20 min， 收集离心上清液，并量体积。收集离心上清液，并量体积。加入固体研磨细粉的硫酸铵至加入固体研磨细粉的硫酸铵至 0.70饱和度（饱和度（ 100 mL加入加入 23.8 g）。 缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置缓慢加入，不断搅拌溶解，置冰箱静置 2 h。室温离心，室温离心， 4000 r/m 20 min， 收集沉淀物。收集沉淀物。0.35饱和硫酸铵上清液饱和硫酸铵上清液沉淀溶于溶于 5 mL含含 0.1 mol/L NaCl 的的 0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5。 装入透装入透析袋，对析袋，对 0.01 mol/L Tris-HCl pH 7.5缓冲液透析平衡，至无缓冲液透析平衡，至无 SO42-被被检测出为止检测出为止粗酶液3.2 比活力测定3.2.1 对硝基苯酚标准曲线的制作 （不做） ：取 15支试管编号， 0号一支， 1 7号各二支，按下列表格操作。管 号 0 1 2 3 4 5 6 7pNP含量 (mol) 0 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.350.5mol/mL pNP (mL)0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7H2O (mL) 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1Na2CO3-NaHCO3 (mL)各管加入 1.0 mL20 mmol/L MgCl2 (mL)各管加入 0.2 mL0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入 2.0 mLOD 405 nm以对硝基苯酚的绝对量 (mol数 )为横坐标， OD405nm值为纵坐标，绘制标准曲线。求出 pNP的克分子消光系数 ()值。 8.80103( mol/L)-1 cm-1管 号 空白 1 2 35 mM pNPP(mL) 各 0.2mLNa2CO3-NaHCO3 (mL) 各管加入 1.0 mL20 mmol/L MgCl2 (mL) 各管加入 0.2 mLH2O (mL) 各 0.50mL混匀， 37 ， 5分 钟酶 液（ mL） / 各 0.1mL37 ，精确反 应 10分 钟0.1 mol/L NaOH (mL) 各管加入 2.0 mL酶 液（ mL） 0.1mLOD 405 nm3.2.2 酶活力的测定以 0号管调零点，测定各管的 OD405nm值，从对照标准曲线求出产物的 mol数，算出酶活力。管号 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 加 酶时间（ min）0.5m1m 1.5m 2m 2.5m 3m 3.5m 4m 4.5m 5m加NaOH时间10.5 11 11.5 12 12.5 13 13.5 14 14.5 15反 应时间（ min）10 10 10 10 10 10 10 10 10 103.2.3蛋白浓度的测定本实验采用紫外吸收法（ OD280） 测定蛋白浓度 。n 上述分离提取的三步酶制剂按一定比例用Tris-HCl缓冲液稀释，稀释倍数视溶液的蛋白浓度高低而定。（一般稀释 5-10倍）。3.3 结果处理计 算：式中： A为 稀 释 倍数， B为 由 标 准曲 线查 得的 pNP mol数， t为 反 应时间 ， C为 由 标 准曲 线查 得的蛋白mg数， V1为测 定 酶 活力所用的 酶 量 (mL数 ) V2为测定酶活力所用的酶量 (mL数 )酶的比活力（ U/mg） 酶 活力（ U/mL）蛋白浓度（ mg/mL）纯化倍数 =各步比活力 /第一步比活力得率 %=各步总活力 *100/第一步总活力将测定的数据或计算结果用下表记录。（本实验不做） 步骤 总体积 mL蛋白mg/mL总蛋白mg酶活力U/mL总活力U比活力U/mg纯化倍数得率%匀浆过滤液 400 7.24 20.3 正丁醇处理上清液 470 33.8 0.35饱和 (NH4)2SO4上清液440 35.3 0.7饱和 (NH4)2SO4沉淀溶解透析上清液40.3 314.7 DEAE-32酶液 9.6 3.82 1002.2Sephadex G75酶液 13.2 0.4