生物化学实验10凝胶过滤层析3

实验十 凝胶过滤柱层析纯化碱性磷酸酶一、目的要求1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。2.通过凝胶过滤柱层析对碱性磷酸酶进行纯化二、原理 凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。 内水体积 Vi 外水体积 Vo 柱床体积 Vt 洗 脱体积 Ve Vt=Vo+Vi+Vg Ve=Vo+KdVi Kd=(Ve-Vo)/Vi Kd=0 Kd=1 01 优点：a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析柱可反复使用 凝胶的类型：Sephadex: 交联葡聚糖 Sepharose： 琼脂糖凝胶 Bio-Gel ABio-Gel P： 聚丙烯酰胺凝胶分子筛Sephacryl： 用 N， N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝胶G-10 G-15 G-25 G-50 G-75 G-100 G-150 G-200吸水量（ g/g干凝胶）1.0 1.5 2.5 5.0 7.5 10.0 15.0 20.0工作范 围（ 肽 与蛋白） D700 1500 5000 1500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000 凝胶及柱的选择凝胶的处理及装柱凝胶干粉的溶胀（热溶胀）、浮选、抽气、装柱、蓝色葡聚糖检查、平衡装柱时要注意操作压。装柱的两种方法：a.手工操作1/3床体积水 加入少许凝胶积起 1-2厘米凝胶床 打开出水口 连续缓慢加入凝胶b.电动搅拌下的装柱法（如图 4-9） 样品上柱分析用量：柱床体积的 12%制备用量：柱床体积的 1020% 洗脱收集部分收集器、核酸蛋白检测仪 凝胶的保存方法0.02%叠氮钠或 0.002%洗必泰 应 用a. 分离蛋白质b. 脱盐c. 蛋白质分子量的测定三、仪器的使用核酸蛋白检测仪及部分收集器的操作方法 核酸蛋白检测仪及记录仪 操作方法1、在仪器使用前，首先检查检测器，电源和记录仪三部份电路连接是否正确，插上电源插头。2、接通记录仪电源开关，使电源开关拔到 “通 ”指示灯亮。可根据需要调换不同的走纸速度。 记录仪 量程调在 10mV档上。3、将检测仪波长旋钮旋到所需波长刻度上，把量程旋钮拔到 100 T档。4、按下检测仪电源箱面板上的电源开关，此时记录仪指针从零点开始向右移动某一刻度，调节 “光量 ”旋钮使指针停留在记录仪大约中间位置 5mV左右数字显示为 50左右。仪器开机稳定时间大约在 1小时左右，待基线平直后，可加样测试。5、把检测器进样口塑料管接到部份收集器上，使层析柱中的洗脱液通过。透光率为 “0”厂家巳调好，光密度 A要调零，量程开关拔到 100 T， 调节光量旋钮，使记录仪指针在 10mV数字显示为 100，即透光率为 100%。把量程开关拔到 “A”挡，缓慢调节 A调零旋钮，使 检测仪 数字显示为 “0” ， 同时调节记录仪零位旋纽使记录仪指示在 “0“位 。6、上述 5个步骤结束后，就可以在层析柱上加样。当样品经层析柱分离，通过检测后，就能通过记录仪给出所需样品吸收的图谱。7、测试完毕，必须切断电源，并用蒸馏水清洗样品池和尼龙管。 记录仪光吸收 A读数当采用 l0mV量程记录仪时，记录仪的满量程读数对应于 A量程开关所对应的 A读数范围。如 A量程开关选定在 0-0.5A时，则记录仪满量程光吸收 A读数为 0.5，当记录笔指示在记录纸一半 (50%刻度 )位置时即为 0.25A。 数字显示光吸收 A读数 (可变量程读数模式 )当 A量程开关选定在 0-1.0A档时，此时数显板上显示和读数即为光吸收 A的实际读数，如显示为 080即表示为 0.80A。当 A量程开关切换在其它量程位置时，则数显光吸收A读数为 :A量程选定在 0-2.0档时，数显读数 2=实际光吸收读数 AA量程选定在 0-1.0档肘，数显读数 1=实际光吸收读数 A部分收集器 的操作方法1将 “ 手 /自 ” 框内的键置于自动状态，按 “ 定 ” 和“停 ”;使定时时间为零，放开 “ 停 ” 按 “ 快 ” 或 “ 慢” (“ 定 ” 仍按着 )至所需的定时时间，放开 “慢 “和 “定 ”，再按一下 “停 “设定定时时间工作就完毕。若要查看设置时间，则只需按一下 “ 定 ” 键，就能显示上一次所设时间，若要以秒显示走时时刻，则需按下 “ 秒 ” 键。 2定位，将 “顺 /逆 ”键置于 “顺 ”或 “逆 ”状态，按 “手动 ”键，使试管架转至终点，这时报警器工作，报警指示灯亮，然后将 “顺 /逆 ”键置于 “逆 ”或 “顺 ”状态，本仪器就会自动地对准第一个试管 (在 “顺 ”状态，第一臂试臂为最外的那根。 在 “逆 ”状态，第一臂试管为最内的那根 )。如滴管口没对准第一根试管只要松开换节臂调整螺钉，使滴臂口对准第一根试管即可。移液器 （俗称 “枪 ”）的使用：四、操作方法（一）凝胶的选择与处理1.凝胶及柱的选择选择 Sephadex G100和 1.5cm60cm的 柱子 。2.凝胶的处理凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于 5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸， 1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。（二）装柱1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将凝胶上面过多的溶液倾出。2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约 5cm高度 柱容积的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约 2-3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约 5cm处时停止装柱，关闭出水口。（三）凝胶柱的平衡通过 2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。 （ 四 ）加样1.准备好 部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪 。柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。 核酸蛋白检测仪的量程置于 2A， 记录仪 量程置于 10mV， 走纸速度设定0.5mm/min。2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直至与胶面相切。沿管壁将 碱性磷酸酶 样品溶液 2mL小心加到凝胶床面上，应避免将柱床面凝胶冲起，打开下口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样操作，用1mL洗脱液冲洗管壁 2次。最后凝胶上方加满洗脱液，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通洗脱瓶。上样和洗脱的流速为 0.3mL/min左右。（ 五 ）洗脱洗脱时，打开上、下进出口夹子，用 0.01mol/LTris-HCl洗脱，用自动部分收集器收集流出液，每管 2mL 。(六）碱性磷酸酶活力峰收集对部分收集器收集的洗脱液进行碱性磷酸酶活力测定，收集碱性磷酸酶活力峰，即为经凝胶过滤柱层析纯化的洗脱液 。 对合并后的碱性磷酸酶活力峰进行酶活和蛋白浓度的测定，即可得到其比活力。五、注意事项1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。2）装柱要均匀，既不过松，也不