甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用

甲壳质套管联合骨髓间充质干细胞对脊髓损伤修复的作用阿丽娅，宋有鑫，姜保国 北京大学人民医院创伤骨科基金支持：国家 973重大基础研究项目 (2003CB515306)背景介绍中枢神经系统损伤危害传统脊髓损伤的治疗策略组织工程再生医学概念支架材料 + 种子细胞（生长因子 ）支架材料的研究趋势 天然支架材料人工合成不可降解支架材料人工合成生物可降解支架材料甲壳质套管中空圆柱形套管 (北京大学人民医院与中国纺织科学院共同发明，专利号 :01136314.2),套管尺寸 :壁厚 0.1mm,内径 1.5mm。是一种天然高分子聚合物 ,学名为 (1 ,4)-2-乙酰氨基 -2-脱氧 -D-葡萄糖 。甲壳质来源于天然海洋生物生物体结构物质 ,可被体内的酶分解而吸收 ,具有良好的吸湿性、纺丝性和成膜性。生物学特性 对生物体无毒性和炎症反应 易于在体内降解吸收 降解吸收周期适宜，可人为调控 前期实验已证实 “甲壳质套管能够促进损伤后的周围神经再生 ” 种子细胞 骨髓间充质干细胞 神经干细胞 雪旺氏细胞 嗅鞘细胞 目的：初步探讨对脊髓损伤修复是否有影响甲壳质套管 + 骨髓间充质干细胞一 、 材料和方法-材料准备 甲壳质套管：无菌 3-4mm 骨髓间充质干细胞（ mesenchymal stem cell, MSCs)体外培养品系：雄性小鼠 C57BL，表达绿色荧光蛋白体重： 20g2取材：股骨 、 胫骨 、 髂骨换液培养，取传代后第 3代细胞移植（ 异种移植 ）d e fa b c第三代三种形态a-c MSCs传代后的第 3代； d-f MSCs的三种形态； a,d MSCs自发荧光； b,e 透射光照射图像； c,f 前两图的叠加效果 . 蓝红黄箭头：多角形，扁平不规则形，纺锤形 实验动物70只雄性 SD大鼠，体重约 30025g动物模型为脊髓右侧半横断伤，随机分 4组 ,每组 20只（除正常组）u正常组 ： 10只 对照组：单纯半切损伤模型，不予任何治疗； 甲壳质套管治疗组：半切损伤后套管植入治疗； 甲壳质套管联合 MSCs组 : 半切损伤后套管植入 ,移植细胞；取材时间点 : 2w,4w,8w,14w,长期组（ 组）1d,5d,7d,4w,8w（ 组）脊髓半切损伤动物模型制作流程-方法和评估指标1 套管内 脊髓损伤位点 组织学观察1.1 脊髓空洞 （免疫组化 -HE染色）8w时组织固定 、 脱水 、 浸蜡 、 包埋、切片， HE染色1.2 胶质瘢痕 （免疫荧光 -检测星形胶质细胞， GFAP染色）2w/8w组织固定 -再后固定，包埋，冰冻切片，丙酮固定后洗片封闭，分别加入抗大鼠 GFAP蛋白一抗和相应二抗 1.3 轴突 （透射电镜 - 2W 和 14W 时检测超微结构）戊二醛固定，后固定，脱水包埋，切片，复染后观察2. 检测 神经纤维是否穿越损伤位点2.1 神经逆行性示踪： 对照组 、 套管组分别在 2周 、 14周于损伤位点远端注 射 10%BDA, 多点注射， 10天后取大脑和脊髓，脊髓分为近段、远段和损伤段，染色显影，阳性细胞计数2.2 功能学评价 ： BBB功能评分；知觉功能评分，分别在术后1w， 2w， 4w， 6w， 8w， 10w， 12w, 14w检测3. 检测 MSCs在套管内的生长情况 ：激光共聚焦显微镜 观察是否增殖 、 迁移，分别在 1d， 5d，7d， 4w， 8w检测二、实验结果1 脊髓损伤位点组织学观察 A B套管组术中和术后大体形态观察A:建立脊髓半横断模型后套管缝合 (4x)； B： 6个月后损伤脊髓套管缝合的外观（ 4x） 1.1 脊髓空洞（ 8W） CA B脊髓损伤位点免疫组化染色A：套管组 (100x)， B： MSCs移植组 (100x)； C：对照组（ 100 x），均为 8W1.2 胶质瘢痕（ 2W）脊髓半横断后星形胶质细胞形态的变化A， B套管联合干细胞组脊髓损伤近远端的星形胶质细胞形态； C， D对照组脊髓损伤近远端星形胶质细胞的形态，均为 400xA BC D套管联合干细胞组对照组套管联合干细胞组对照组近端 远端1.3 脊髓内部超微结构 -轴突 A B CD E髓鞘在不同时间点形态（ 10000x）A：正常轴突； B： 2W时套管干细胞组轴突； C： 2W时对照组轴突 ; D: 14W时套管干细胞组轴突 ; E: 14W时对照组轴突2 检测神经纤维穿越损伤位点 A B C神经逆行示踪阳性细胞及神经纤维A：正常大鼠大脑， 400x; B： 14w时套管干细胞组大脑， 400x; C: 14w 时套管干细胞组脊髓神经纤维， 100x 2.1 逆行示踪结果阳性细胞计数*2.2 功能学评价 -BBB评分02468101214161 2 4 6 8 10 12 14Time (Weeks)BBB ScoreT组T+M组CON组粉线代表 MSCs移植组；蓝线代表套管组，黑线代表对照组-知觉功能评分00.511.522.533.51 2 4 6 8 10 12 14Time (Weeks)Sensory ScoreT组T+M组CON组粉线代表 MSCs移植组；蓝线代表套管组，黑线代表对照组； 0代表没有任何知觉， 4代表知觉完全正常3 检测 MSCs在套管内的生长情况 a b ca-c, MSCs移植 1天后的分布 ,脊髓远端； d-f, MSCs移植 4W后的分布，脊髓远端； g-i， MSCs移植 8W后的分布，脊髓近端； a, d, g为荧光照射；b, e, h为透射光照射； c, f, i为前两图叠加效果一天远端 3.1 MSCs 在脊髓中迁移和分布d e fg h i四周远端八周近端3.2 MSCs在脊髓中增殖 a b cd e fu八周u五天MSCs在大鼠脊髓中生长状态a-c, MSCs移植 5天时的状态； d-f, MSCs移植 8W时的状态，可见细胞生长状态良好，且大量的增殖 . a, d为荧光照射； b, e为透射光照射； c,f为前两图叠加 三、小结与讨论小 结 从组织学、功能学角度评价脊髓半横断损伤后再生状况（ 1）长期观察发现本实验用到的甲壳质套管在脊髓中有 固形作用（ 2）应用甲壳质套管或复合 MSCs， 脊髓空洞、胶质瘢痕均相对减少，髓鞘再生状态良好 ；但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显（ 3）应用甲壳质套管或复合 MSCs，发现大鼠 运动功能和知觉功能均得到明显的改善 ，功能恢复均显著优于单纯脊髓半切，逆行示踪结果也表明神经再生过程中， 部分神经纤维跨过损伤位点生长 ；但套管组和套管联合干细胞组之间比较差异不明显。MSCs移植脊髓损伤位点后，发现：（ 1） MSCs在脊髓中能够从损伤位点远端向近端迁移，从脊髓边缘向中央迁移（ 2） 8周时干细胞大量增殖讨