硝基四氮唑蓝还原试验

硝基四氮唑蓝还原试验Nitroblue Tetrazolium Reduction Test实验原理这是用于检查机体细胞免疫功能的一种方法。硝基蓝四氮唑，又称四氮唑蓝(nitroblue tetrazolium， NBT)，是一种水溶性的淡黄色活性染料，当其被嗜中性粒细胞的酶还原后，则变为非水溶性的蓝黑色甲臜 (Formazan)颗粒，沉淀于胞浆内。当机体受细菌、真菌和寄生虫感染时，嗜中性粒细胞的吞噬能力明显增强，还原 NBT的能力亦随之增高，但病毒性感染或非感染性疾病则不增高，故可利用 NBT还原试验作为诊断全身性感染的一种辅助方法，并作为判定嗜中性粒细胞杀菌功能的指标，以诊断吞噬功能缺陷症。一般认为在细菌感染过程中，嗜中性粒细胞能量消耗骤增，氧的消耗量增加，己糖磷酸旁路糖代谢活性加强，葡萄糖分解的中间产物葡萄糖 6磷酸在此旁路中脱氢氧化而成为戊糖。所脱出的氢被吞入或渗入胞浆内的 NBT接受，则还原成为点状或块状的蓝黑色甲臜颗粒，沉积于细胞浆内。白细胞根据形态差异可分为有颗粒和无颗粒两大类，无颗粒的白细胞有淋巴细胞和单核细胞两种。颗粒白细胞（粒细胞）中含有特殊染色颗粒，用瑞氏 -吉姆萨染液可分辨出三种颗粒白细胞即 嗜中性粒细胞 、 嗜酸性粒细胞 和 嗜碱性粒细胞。 绝大部分的粒细胞是嗜中性粒细胞。嗜中性粒细胞 ，简称中性粒细胞（ neutrophilic granulocyte），是白细胞中数量最多的，约占全部白细胞的 50左右，呈圆形，胞质淡红色，内含有 多量的紫红色微粒 （不易看清）。胞核随细胞成熟的程度而不同，幼稚型的呈杆状或马蹄形，成熟的呈分叶状，三叶的较多见，老龄的有8 9叶或更多。嗜酸性粒细胞 ， (拉丁学名： Eosinophil)：细胞质内含 深红色大型颗粒 ，颗粒内含有过氧化物酶和酸性磷酸酶。其细胞核的形状与嗜中性白细胞相似，通常有 2 3叶，约占白细胞总数的 4。嗜碱性粒细胞 ，数量很少，约占 0.6，大小与嗜酸性颗粒细胞基本相同。胞质内含有 大的蓝紫色颗粒 ，胞核也分叶。主要试剂与器材1、待测样本：新鲜肝素抗凝血；2、 NBT溶液：取 NBT 0.2g和聚蔗糖 20mg，溶于 100ml生理盐水中，过滤，分装， 4 保存备用；3、肝素溶液；4、瑞氏 -吉姆萨染液，甲醇， pH7.2 PBS，生理盐水等；5、主要器材：采血针， 75%酒精棉球，载玻片，湿盒， 37 恒温箱，显微镜等实验操作方法1、载玻片上滴加 20-30ul肝素溶液；2、 75%酒精棉球对受试者手指尖消毒，干燥后用采血针针刺，轻柔挤出血，吸取约 40-60ul血液，与载玻片上的肝素混匀；3、加入 NBT溶液一滴，轻轻吹吸混匀；4、置于湿盒中，放入 37 恒温箱孵育 15min后，转至室温再放置 15min，并轻轻摇匀；5、将载玻片上的待检样本制成血涂片（ 采取推片法 ），自然晾干；6、滴加瑞氏 -吉姆萨染液染色，具体步骤如下：1）平置血涂片于桌面或染色架上，滴加试剂一 3-5滴，使其迅速覆盖血膜，染色 1分钟，与固定血膜；2）不要丢弃试剂一，直接滴加试剂二 6-10滴，轻摇玻片使染色液充分混匀，染色 5-8分钟；3）水洗后，待干后镜检。染色结果观察1）红细胞呈浅红色，中央稍淡。2）白细胞系统清晰易分，细胞膜清晰呈紫黑色，细胞核的着色呈深浅不一的紫红色，胞浆呈浅红色。胞浆中的各种颗粒区分明显：（ A）中性粒细胞胞浆中颗粒呈紫红色、嗜酸性粒细胞胞浆中颗粒呈桔红色、嗜碱性粒细胞胞浆中颗粒呈蓝褐色；（ B）单核细胞的胞浆呈灰蓝色，胞浆中颗粒呈细小淡紫红色或蓝紫色；（ C）淋巴细胞胞浆呈淡蓝色。3）凡中性粒细胞胞浆中含有蓝色甲臜颗粒者为 NBT阳性细胞，计数 100个中性粒细胞，计算 NBT阳性中性粒细胞百分率。正常人外周血中性粒细胞 NBT阳性率约为 10%。注意事项1、 推片：取反应溶液 1-2滴置载玻片上，将推玻片保持与载玻片 30角，置于溶液正前方，稍往后移与溶液接触，可见溶液沿推片下缘散开，再匀速沿载玻片平面平稳前移，至溶液铺完为止；2、 涂片时不要太厚也不要太薄，太厚时红细胞容易重叠并易皱，太薄时又不容易找到白细胞；3、 血溶液要干透后才能染色，否则染色时血膜容易脱落；4、 染液一和染液二不能过少，以防染液蒸发引起染液沉淀，染液一不可少于400ul，染液二的量是染液一的 2倍，滴加染液一和染液二时要轻摇玻片，时溶液迅速布满血膜或使染液迅速而充分地混合；5、 镜检时如果红细胞偏蓝，请放在蒸馏水中 1-3分钟，直至红润为止；6、 如果染色过淡，可复染；染色过深可用水冲洗或浸泡，还可用 75%的乙醇脱色 3-5秒钟后，再镜检观察；7、 沉着的甲臜颗粒形状不一，有的呈大块状，有的呈点状或放射状。涂片要均匀，以便清楚地看到甲臜沉着物，并能更好地区别嗜中性白细胞及单核细胞。因为单核细胞还原 NBT的能力也很强，不应将其计算在 NBT阳性细胞内。免疫小鼠抗血清的制备1、采用眼球放血法，每组收集 2只免疫小鼠的所有外周血至一洁净干燥的小平皿中，不要放抗凝剂！2、盖上平皿盖，斜置于 4 冰箱，过夜，待血清充分析出；3、第二天，收集析出的免疫小鼠抗血清，注意要适当剥离和破碎凝血块，充分收集血清