第三章：酶工程动植物细胞培养产酶

第三章 动、植物细胞培养产酶与微生物细胞相比，动物细胞和植物细胞具有各自不同的特性，需采用各自不同的培养工艺。 植物细胞结构植物、动物、微生物细胞的特性比较细 胞种 类 植物 细 胞 微生物 细 胞 动 物 细 胞细 胞大小 /um 200 300 1 10 10 100倍增 时间 /h 12 0.3-6 15营 养要求 简单 简单 复 杂光照要求 大多数要求 不要求 不要求对 剪切力 敏感 大多数不敏感 非常敏感主要 产 物 色素、 药 物、香精、 酶 等醇、有机酸、氨基酸、抗生素、核苷酸、 酶 等疫苗、激素、单 克隆抗体、酶 等三者之间的差异主要有：植物细胞 动物细胞 微生物细胞。动物细胞、植物细胞的生产周期比微生物长。植物细胞和微生物细胞的营养要求较简单。植物细胞的生长以及次级代谢物的生产要求一定的光照。植物细胞和动物细胞对剪切力敏感。植物、微生物和动物细胞的主要目的产物各不相同。一、植物细胞培养产酶从外植体中 选育植物细胞 高产稳定细胞 培养 各种产物1.植物细胞培养的特点提高产率和产品质量缩短周期易于管理2.培养基特点 需要大量无机盐 需多种维生素和激素 氮源一般为无机氮 一般以蔗糖为碳源n 应用最广的是 MS培养基和 LS培养基MS培养基是 1962年为烟草细胞培养而设计的培养基。 LS培养基是在其基础上演变而来的。 P82表 3-33.培养工艺： 悬浮细胞培养 工艺流程外植体 细胞的获取 细胞培养 分离 纯化产物 外植体选择和处理选取那些无病虫害、生长旺盛、生长规则植株，把茎、叶、根、芽，花、果实等切成小片段或小块。用70%-75%乙醇， 0.1%升汞消毒，无菌水漂洗。外植体：从植株取出，经过预处理后，用于植物组织培养的植物组织（包括根、茎、叶、芽、花、果实、种子等）的片段或小块。愈伤组织：将上述外植体植入诱导培养基中，于 25 左右培养一段时间，从外植体的切口部位长出小细胞团。水稻的外植体（幼胚）和愈伤组织外植体愈伤组织 植物细胞获取直接分离法愈伤组织诱导法原生质体再生法 细胞悬浮培养：转新培养基，在生物反应器中进行培养 分离纯化：生化技术机械法酶法 培养条件的影响与控制 温度：室温 25pH ：微酸性范围。即 pH 5.0-6.0 通气与搅拌 光照的控制：强度和时间有一定要求 前体的添加（饲喂） 刺激剂的应用4.植物细胞培养产酶实例以大蒜细胞培养生产超氧化物歧化酶（ SOD） 为例(1)大蒜愈伤组织的诱导选取结实、饱满、无病虫害的大蒜蒜瓣， 去除外皮，先用 70%乙醇消毒 20s， 再用 0.1%升汞消毒 10min， 然后无菌水漂洗 3次。在无菌条件下，切成 0.5cm3的小块，植入含有3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的半固体 MS培养基中，在 25 ， 600lux， 12h/d光照条件下培养 18d， 诱导得到愈伤组织，每 18天继代一次。(2)大蒜悬浮细胞培养将上述在半固体 MS培养基上培养 18d的愈伤组织，在无菌条件下转入含有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA （ 苄基腺嘌呤） 的液体 MS培养基中，加入灭菌的玻璃珠， 25 ， 600lux， 12h/d光照条件下震荡培养 18d， 使愈伤组织分散成为小细胞团或单细胞。然后在无菌条件下，经过筛网将小细胞团或单细胞转入含有 3mg/L 2,4-D和 1.2mg/L 6-BA 的液体MS培养基中， 25,600lux ， 12h/d光照条件下震荡培养 18d。(3)酶的分离纯化细胞培养完成后，收集细胞，经过细胞破碎、提取、分离得到超氧化物歧化酶。二、动物细胞培养产酶1.动物细胞培养的特点动物细胞可以产生各种有效高价值的物质需添加抗生素 （常用青霉素和链霉素联合）细胞生长速度慢细胞体积大，无细胞壁保护，对剪切力敏感。反应过程成本高，产品价格贵细胞具有锚地依赖性。宜采用贴壁培养原代细胞一般繁殖 50代2.培养方式 (1)悬浮培养(2)贴壁培养滚瓶培养微载体培养 (microcarrier culture)(3)固定化细胞培养包埋 (entrapment)和 中空纤维 (microencapsulation)培养3.工艺控制 工艺流程种质细胞 （体细胞；杂交瘤细胞） 分散成悬浮细胞 细胞悬浮或贴壁培养 收集 分离纯化 产物胰蛋白酶消化 培养条件的影响与控制 温度：一般控制在 36.5.pH 值：一般控制在 7.0-7.6的微碱性范围内。 渗透压 : 应与细胞内渗透压相同。 溶解氧：根据情况随时调节。4.产酶实例以人黑色素瘤细胞培养生产组织纤溶酶原激活剂为例纤溶酶原 纤溶酶纤溶酶原激活剂 种质细胞用胰蛋白酶处理，分散， pH7.4磷酸盐洗涤。稀释成细胞悬浮液 接种到反应器中，与 37 CO 2培养箱中，长成致密单层 去培养液，用 pH7.4磷酸盐冲洗细胞 换无血清 Eagle培养液，继续培养 每 3-4天，取出培养液分离纯化 再加新鲜 Eagle培养液，继续培养 亲和层析进行分离细胞生产滚瓶培养装置第一章作业：1.概念酶活力单位酶比活力2.酶工程的主要任务和主要内容是什么？3.写出酶活力测定的一般步骤。第二章作业：1.概念：产物阻遏；分解代谢物阻遏；酶合成的诱导2.提高酶产量的策措施有哪些？3.试述发酵过程中对溶解氧进行控制的必要性及其依