第六章细菌对抗菌药物敏感性与耐药性

微生物学检验第六章细菌对抗菌药物敏感性与耐药性本 章 内 容第一节 临床常用抗菌药物1第二节 抗菌药物敏感试验2第三节 分枝杆菌的药物敏感试验3第四节 细菌的耐药性检查4学习目标学习目标： 1掌握 抗菌药物敏感试验常用方法，纸片扩散法（ K-B法）的操作方法、结果判断及实验质量影响因素2熟悉 耐药表型检测； - 内酰胺酶检测方法；超广谱 - 内酰胺酶（ ESBLs）检测方法3了解 临床常用抗菌药物种类；药敏试验中药物选择原则本章重点： 纸片扩散法（ K-B法）的操作方法及结果判断 药敏试验的临床意义第一节 临床常用抗菌药物一、 抗菌药物分类1.- 内酰胺类：抑制转糖基酶、转肽酶、 D-羧肽酶、内肽酶，从而细菌细胞壁合成。2.氨基糖苷类 ：抑制 mRNA的转录和蛋白质的合成。 3.喹诺酮类：作用于 DNA旋转酶，干扰细菌 DNA复制、修复和重组。4.大环内酯类：结合细菌核糖体 50S大亚基，抑制细菌蛋白质合成和肽链延伸。5.糖肽类：阻断肽聚糖合成，阻阻碍细胞壁合成。第一节 临床常用抗菌药物一、 抗菌药物分类6.磺胺类：竞争性与二氢叶酸合成酶结合，使核酸合成抑制。7.四环素类：结合细菌 30S核糖体亚基，抑制蛋白质合成。8.氯霉素类：作用细菌 70S核糖体的 50S亚基，抑制蛋白合成。9.林可酰胺类：结合细菌核糖体 50S大亚基，抑制蛋白质合。10.其他抗菌药物：硝基肤喃类、硝基咪唑类、链阳霉素类、噁唑烷酮类等。二、常规药敏试验药物选择原则我国主要遵循美国临床实验室标准化委员会（ CLSI）制定的抗菌药物选择原则。第一节 临床常用抗菌药物返回章内容U组：仅用于治疗泌尿道感染的药物。C组：在 A、 B组药物过敏或耐药时选 用；B组：只在 A组药物耐药、过敏、无效 时选择性报告 ;A组：包括对特定菌群的常规试验并常 规报告的药物；第二节 抗菌药物敏感试验一、概述测定抗菌药物在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏感试验（ AST）抗菌药物敏感试验方法纸片扩散法 稀释法 E-test法菌株被推荐剂量治疗感染部位可达到的抗菌药物浓度抑制药物在生理浓集部位有临床效果，还代表敏感与耐药之间缓冲区菌株不能被常规剂量抗菌药物可到达的浓度所抑制敏感（ S）耐药（ R）中介（ I）抗菌药物敏感试验结果第二节 抗菌药物敏感试验二、纸片扩散法含有定量抗菌药物纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含药物吸收琼脂中水分溶解后向纸片周围区域扩散，形成递减的梯度浓度。纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，形成透明抑菌圈。抑菌圈大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（ MIC）呈负相关关系。第二节 抗菌药物敏感试验二、纸片扩散法1.水解酪蛋白（ MH）培养基， pH7.2 7.4，做成琼脂厚度 4mm，直径 90mm的平板2.挑取孵育 16 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度至 0.5麦氏标准第二节 抗菌药物敏感试验二、纸片扩散法3.用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液4.在 MH琼脂表面均匀涂布接种 3次，每次旋转平板 60度，最后沿平板内缘涂抹 1周5.平板在室温下干燥 3 5min，用无菌镊子或纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于 24mm，纸片距平板内缘大于 15mm第二节 抗菌药物敏感试验二、纸片扩散法6.平板置 352 孵育箱， 16 18小时后判读结果。苛养菌应在含 5%CO2环境中培养 20 24小时7.用游标卡尺或直尺量取抑菌圈直径。按照 CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药第二节 抗菌药物敏感试验纸片扩散法图解抑菌圈细菌生长药敏纸片细菌菌落抗生素浓度 耐药敏感第二节 抗菌药物敏感试验三、稀释法以一定浓度的抗菌药物与培养基进行一系列不同倍数稀释，经培养后观察被试菌株的最低抑菌浓度，根据 CLSI提供的 MIC解释标准判断细菌对抗菌药物的敏感程度。稀释法中使用肉汤培养基为肉汤稀释法，使用琼脂培养基为琼脂稀释法第二节 抗菌药物敏感试验三、稀释法1. 肉汤稀释法浓度 4 8 16 32 64 128 256 g/ml 混 清抗菌药物素倍比稀释，接种菌 105CFU/ml ， 孵育温度 35 ，16 20h，判读结果。第二节 抗菌药物敏感试验三、稀释法2.琼脂稀释法浓度 16 32 64 128 256 g/ml 制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104/每点，孵育 35 ， 16 20h ，判读结果第二节 抗菌药物敏感试验四、 E-test法E-test法（ epsilometer test）结合了扩散法和稀释法的原理和特点，对抗菌药物直接测量 MIC。 E试条为宽 5mm、长 50mm的无孔试剂载体，一面固定有浓度呈连续指数增长的抗菌药物，另一面有所含药物浓度的刻度细菌生长区E test 塑料条椭圆形细菌生长抑制区2561288016判读抑菌浓度（ MIC ug/ml)第二节 抗菌药物敏感试验四、 E-test法1.菌液制备及接种均同纸片扩散法2.于 90mm平板上可放 E试验试条 1 2条， 140mm平板最多可放 6条3. 孵育、温度及时间同纸片扩散法4.读取椭圆形抑菌环与 E试条的交界点值即为 MIC第二节 抗菌药物敏感试验五、质量控制1.影响纸片扩散法的因素(1) 培养基厚度(2) 细菌浓度(3) 抗菌药物含量、扩散性(4) 温度，预孵育时间(5) 判定标准(6) 质控标准菌株第二节 抗菌药物敏感试验五、质量控制2.质量控制的要求（ 1）质控菌：标准菌株来源国家微生物菌种保藏中心。标准菌株应每周在 MH琼脂上传代一次， 4 保存（ 2）质控方法：在同一条件下，将新鲜传代质控菌株用与常规实验相同的测定药物进行相同的操作方法后，测定质控菌株的抑菌环，以便对照监测（ 3）抑菌圈质控范围：标准菌株的抑菌圈应落在规定范围内，范围为 95%的可信限返回章内容第二节 抗菌药物敏感试验一、结核分枝杆菌体外药敏试验指征 首次从患者标本分离的分枝杆菌需做药敏试验，有助于临床合理用药和监测其药物敏感性。经过三个月正规抗结核治疗，标本中分枝杆菌分离培养仍为阳性的患者或重症患者，以及来自高耐药结核分枝杆菌流行区的患者，均须做体外药敏试验。 第三节 分枝杆菌的药物敏感试验二、 体外药敏试验 绝对浓度法1.药物溶液配制 药物先制成高浓度药液，再按比例稀释成低浓度药液 .含药培养基 每 100ml改良罗氏培养基加入 1ml配制、稀释好的抗结核药液，无菌分装 7ml/管， 85 凝固。 .菌悬液 培养物以 0.5%吐温 -80生理盐水稀释，与标准麦氏比浊管 No.1比浊 .接种 1mg/ml菌悬液 10倍稀释至 102mg/ml，无菌吸取菌液0.1ml分别接种于含药培养基和对照培养基斜面。 37 培养，四周观察结果第三节 分枝杆菌的药物敏感试验二、 体外药敏试验 绝对浓度法 .结果报告 按下列方式报告对照培养基及含药培养基菌落情况：返回章内容第三节 分枝杆菌的药物敏感试验一、细菌耐药性与耐药机制 1.产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶2.抗菌药物作用靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、 DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶 的改变等3.抗菌药物渗透障碍，包括细菌生物被膜形成和通道蛋白丢失4.药物的主动转运系统亢进上述四种耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。第四节 细菌的耐药性检查二、耐药表型检测 1.- 内酰胺酶检测（ 1） -内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中。（ 2）检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。第四节 细菌的耐药性检查二、耐药表型检测 2超广谱 - 内酰胺酶检测 l ESBL指由质粒介导的能水解青霉素类、头孢菌素类和单环 内酰胺类氨曲南的一类酶。l ESBLs不能水解头霉素类和碳青霉烯类药物，能被克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦等 内酰胺酶抑制剂所抑制。第四节 细菌的耐药性检查二、耐药表型检测 2.超广谱 - 内酰胺酶检测（ 1）纸片扩散法 表型初筛试验出现以下一种情况即可怀疑菌株产生 ESBL（筛选阳性）： 头孢泊肟 17mm 头孢他啶 22mm 头孢噻肟 27mm 头孢曲松 25mm 氨曲南 27mm第四节 细菌的耐药性检查二、耐药表型检测 2.超广谱 - 内酰胺酶检测（纸片扩散法）（ 1）纸片扩散法表型确证试验头孢他啶和头孢他啶 /克拉维酸、头孢噻