第九章+基因工程

n 第九章第九章 基因重基因重 组组 与基因工程与基因工程 Gene Recombination and Genetic Engineering 转基因植物获得新的性状把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。用噬菌体DNA构建 重组DNA分子用质粒 构建 重组DNA分子n 基因重 组 (gene recombination)是指DNA片段在 细 胞内、 细 胞 间 ，甚至在不同物种之 间进 行交 换 ，交 换 后的片段仍然具有复制和表达的功能。 n 基因工程 (genetic engineering） 是指采用人工方法将不同来源的 DNA进 行重组 ，并将重 组 后的 DNA引入宿主 细 胞中进 行增殖或表达的 过 程。 重重 组组 DNA技技 术术 n 重 组 DNA技 术 又称 为 基因工程 （ genetic engineering） 或 分子克隆 (molecular cloning)。 基因工程的操作 过 程主要由以下步 骤组 成：n 载 体和目的基因的分离；n 载 体和目的基因的切断；n 载 体和目的基因的重 组 ；n 重 组 DNA的 转 化和 扩 增；n 重 组 DNA的 筛选 和 鉴 定。 n 一、一、 载载 体和目的基因的分离体和目的基因的分离n 为 了 进 行基因重 组 ，首先需要 对载 体DNA和目的基因分 别进 行分离 纯 化，得到其 纯 品。 n （一） 载 体： 基因工程中常用的 载 体(vector)主要包括 质 粒 (plasmid)、 噬菌体 (phage)和 病毒 (virus)三大 类 。 这 些 载体均需 经 人工构建，除去致病基因，并 赋予一些新的功能，如有利于 进 行 筛选 的 标志基因、 单 一的限制 酶 切点等。 n 1 质 粒： 是存在于天然 细 菌体内的一种独立于 细 菌染色体之外的 双 链环 状DNA， 具有 独立复制 的能力，通常 带 有细 菌的 抗 药 基因 。 最早使用的 质 粒DNA是人工构建的 pBR322， 该质 粒分子大小 为 4.3kb， 带 有抗四 环 素和抗氨苄 青霉素基因，含 EcoR ， BamH ，Hind 等 单 一的限制 酶 切点。 n 3病毒 ： 常用的 为 SV40， 通 过 感染方式将其 DNA送入哺乳 动 物 细 胞中 进 行增殖。目前 应 用相 对较 少。 n （二）目的基因 ： n 目的基因的 筛选 和分离可采用以下方法 进行： n 1直接从染色体 DNA中分离 ： 仅 适用于原核生物基因的分离， 较 少采用。 n 2人工合成： n 根据已知多 肽链 的氨基酸 顺 序，利用 遗传密 码 表推定其核苷酸 顺 序再 进 行人工合成。适 应 于 编码 小分子多 肽 的基因。 n 4从基因文 库 中 筛选 ： 将某一种基因 DNA用适当的限制 酶 切断后，与 载 体 DNA重 组 ，再全部 转 化宿主细 胞，得到含全部基因 组 DNA的种群，称 为 G文 库 (genomic DNA library)。 将某种 细 胞的全部mRNA通 过 逆 转 合成 cDNA， 然后转 化宿主 细 胞，得到含全部表达基因的种群，称 为 C-文 库 (cDNA library)。 C-文 库 具有 组织细 胞特异性。 n 二、二、 载载 体和目的基因的切断体和目的基因的切断n 通常采用 限制性核酸内切 酶(restriction endonuclease)， 简 称限制 酶 ，分 别对载 体 DNA和目的基因进 行切断，以便于重 组 。限制 酶 目前已 经发现 400多种，所 识别 的 顺 序往往 为 4-8个碱基 对 ，且有 回文 结 构 。 由限制 酶 切断后的末端可形成 平端、3-突出粘性末端和 5-突出粘性末端 三种情况。形成粘性末端 (cohesive end)者 较 有利于 载 体 DNA和目的基因的重 组 。 n 三、三、 载载 体和目的基因的重体和目的基因的重 组组n 即将 带 有切口的 载 体与所 获 得的目的基因 连 接起来，得到重新 组 合后的DNA分子。 n （一）粘性末端 连 接法 ： 当 载 体 DNA和目的基因均用同一种限制 酶 进 行切断 时 ，二者即可 带 有相同的粘性末端。如将 载 体与目的基因混合在一起，二者即可通 过 粘性末端 进 行互 补 粘合，再加入 DNA连 接 酶 ，即可封 闭 其缺口，得到重 组 体。 较 少的情况下，对产 生的平端也可直接 进 行 连 接。 n （二）人工接尾法 ： 即同聚物加尾 连 接法。当 载 体和目的基因无法采用同一种限制 酶 进 行切断，无法得到相同得粘性末端 时 ，可采用此方法。 此法首先使用单链 核酸 酶 将粘性末端切平，再在末端核苷酸 转 移 酶 的催化下，将脱氧核糖核苷酸添加于 载 体或目的基因的 3-端，如载 体上添加一段 polyG， 则 可在目的基因上添加一段 polyC， 故二者即可通 过碱基互 补进 行粘合，再由 DNA连 接 酶 连接。 n （三）人工接 头连 接法 ： 将人工 连 接器（即一段含有多种限制 酶 切点的 DNA片段） 连 接到 载 体和目的基因上，即有可能使用同一种限制 酶 对载 体和目的基因进 行切断，得到可以互 补 的粘性末端。 n 四、重四、重 组组 DNA的的 转转 化和化和 扩扩 增增n 重 组 DNA需 导 入宿主 细 胞才能 进 行增殖或表达。