解放军307医院egfr突变检测经验分享

解放军 307医院 EGFR突变检测经验分享刘 毅解放军 307医院 全军肿瘤中心 肿瘤学研究室 350:2129-39EGFR的突变类型 Nature Reviews Cancer 2007;7:169-181肺癌靶向治疗的里程碑： IPASS研究肺癌靶向治疗的里程碑： IPASS研究N Engl J Med 2009;361:947-57肺癌靶向治疗的里程碑： IPASS研究EGFR突变状态指导 TKI类药物的使用EGFR突变状态已成为患者能否在一线使用 TKI药物的重要指标二、怎么做及注意事项目前较为常见的 RGFR突变检测方法 EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念2、基因突变是指 DNA发生碱基序列的改变： 须选择有针对性的检测手段，针对非 DNA的检测手段如： RT-PCR（检测 RNA表达），免疫组化（检测蛋白表达）以及针对非碱基序列的检测手段如： FISH（检测 DNA的扩增、缺失、断裂、融合）等，均不适用。体细胞突变发生在非种系组织中不具有遗传性不会遗传给子代种系突变发生于精子或卵子中可以遗传子代子代所有细胞均带突变1、 EGFR突变为体细胞突变： 发生于肿瘤细胞中，正常细胞（癌旁或白细胞等）不含突变。 要尽可能取到足量的肿瘤细胞进行检测 ，这是保证检测结果可靠的根本前提。肿瘤细胞内及与正常组织间的异质性片段化的 DNA不容易进行扩增EGFR突变检测中需要明确的几个基本概念3、样品特性：异质性，突变细胞或 DNA的含量一般较少， DNA经常会严重片段化4、关键是保证突变 DNA有效扩增至可检测的范围：扩增效率及检测方法的敏感性1、 TapMan 探针法：边扩增边检测优势只检测突变的序列敏感性高且污染几率小不足探针费用较高只能针对已知突变正常 DNA的扩增无限制Nature Reviews Drug Discovery 2004： 3, 749-761突变 DNA有荧光信号野生型 DNA无荧光信号特定的探针：只结合突变序列2、高分辨率溶解曲线（ HRM）：扩增后再检测优势已知和未知突变序列敏感性高且污染几率小不足正常 DNA的扩增无限制对仪器设备的要求较高阳性结果还需进一步确认3、变性高效液相色谱分析（ dHPLC）：扩增后再检测优势敏感性高已知和未知突变序列不足仪器普及率低正常 DNA的扩增无限制开盖检测增加污染几率阳性结果还需进一步确认检测环境需独立且通风良好4、直接测序法：扩增后再检测优势直观且相对成本低已知和未知突变序列不足工作量大且敏感性低开盖会增加污染几率正常 DNA的扩增无限制Sanger测序法原理5、焦磷酸测序：扩增后再检测优势适合已知序列已知和未知突变均可测敏感性高、直观、能够定量不足需要专用仪器正常 DNA的扩增无限制开盖会导致污染几率增加6、突变富集 PCR：扩增后再检测（抑制正常 DNA扩增）优势敏感性高（此消彼长） 不足操作繁琐只针对已知突变开盖导致污染几率增加不好找合适的限制性内切酶 Clin Cancer Res 2006;12(1):43-487、扩增阻滞突变系统（蝎形探针）：边扩增边检测优势敏感性高且污染几率小只扩增并检测突变的序列不足只针对已知突变试剂盒费用较高72 延伸94 解链60 自身杂交发光ARMS引物各种突变检测方法的综合比较 1、操作流程 2、污染几率3、敏 感 性 4、可实施性我们最初采用的方法：直接测序法选择的理由结果直观易懂大量文献支持、金标准实验室条件能够满足要求注意事项： DNA抽提部分新鲜组织 体液（胸水或血浆） 石蜡包埋组织提取过程约 1小时 提取过程约 1小时 提取过程约 3小时1、 DNA提取之前的病理质量控制非常重要，它决定了最终检测结果的可靠性2、尽可能使用认可程度高的试剂，以保证 DNA的提取效率（ TaKaRa DEXPAT）3、严格按照说明书要求保存试剂（温度、湿度等），以免试剂失效4、可按自身需求对操作流程做适当修改，但要形成 SOP操作规范（ 示例 1、 2）5、 DNA提取区域与 DNA扩增后的分析区域要完全分隔，以避免气溶胶污染注意事项： PCR扩增部分 1、 DNA质量控制非常重要，可保证后续实验的顺利进行（模板过量、 PCR抑制剂）2、设置好阴性对照（避免污染）和阳性对照（验证实验体系，必要时可取消）3、选用保真性较高的 Taq酶，避免由实验体系带来的假阳性4、做好详细的实验记录，为以后的各种分析提供依据（ 示例 ）Marker 百倍稀释 原液 空白Marker 空白 19 21 Marker 空白 19 21注意事项： PCR扩增部分 原来的 19号外显子巢式 PCR引物原来的 21号外显子巢式 PCR引物 N Engl J Med 2004;350:2129-39改进后的 19号外显子巢式 PCR引物 改进后的 21号外显子巢式 PCR引物5、巢式 PCR并非必须，如果 DNA的质量足够好，可以选择一次 P