综合性实验一质粒dna的小量制备和电泳鉴定

综合性实验二 质粒 DNA小量制备和电泳鉴定一实验目的1掌握碱变性裂解法制备质粒 DNA的原理。2了解质粒 DNA的性质和用途。3. 掌握 DNA琼脂糖凝胶电泳的原理和操作。4. 掌握质粒 DNA（闭环和开环构型）的电泳分离鉴定。质粒 plasmid质粒是细菌染色体外的环形双链 DNA分子，能在宿主细胞内独立自主的进行复制。质粒基因工程中目的基因的运载工具。质粒载体大小可从 1kb到 200kb筛选标记多克隆位点酶切位点复制原点质粒的特性： 能独立自主进行复制。 细菌内的共生型遗传因子，能垂直遗传。 能赋予宿主细胞一些表型。质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活，而宿主即使没有它们也可以正常存活。质粒的应用质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种 基因运载工具 在基因工程中具有极广泛的应用价值。大多数来自细菌的质粒是 双链 、 共价闭合环状 的分子，以 超螺旋形式 存在。Visualization of topoisomers. In this experiment, all DNA molecules have the same number of base pairs but exhibit some range in the degree of supercoiling. Because supercoiled DNA molecules are more compact than relaxed molecules, they migrate more rapidly during gel electrophoresis.琼脂糖凝胶电泳n 琼脂糖是由琼脂分离制备的链状多糖。其结构单元是 D-半乳糖和 3.6-脱水 -L-半乳糖。许多琼脂糖链依氢键及其它力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。n 因此该凝胶适合于核酸与核蛋白、免疫复合物的分离、鉴定及纯化。在临床生化检验中也常用于 LDH、 CK等同工酶的检测。 影响 电 泳迁移率的因素 ：Friction Charge外加 电 流 、 电压分子量 分子形状 分子的 等 电 点VoltageCATHODEANODE+ -+琼脂糖凝胶电泳分离核酸的基本技术在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中， DNA分子的电泳迁移率与其分子量的常用对数成反比；分子构型也对迁移率有影响，如 共价闭环 DNA直线DNA开环双链 DNA。当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状 DNA（球形）不能进入胶中，相对迁移率为 0，而同等大小的直线 DNA（刚性棒状）可以按长轴方向前移，相对迁移率大于 0。 差速离心DIFFERENTIAL CENTRIFUGATION离心离心 :利用离心机转子利用离心机转子高速旋转产生的强大高速旋转产生的强大的离心力，加快液体的离心力，加快液体中颗粒的沉降速度，中颗粒的沉降速度，把样品中不同沉降系把样品中不同沉降系数和浮力密度的物质数和浮力密度的物质分离开分离开 。二实验原理质粒提取原理质粒提取有多种方法，但都包含三个基本步骤：1. 培养细菌使质粒扩增2. 收集裂解细菌3. 分离纯化质粒 DNA去除蛋白质 去除 RNA 去除基因组 DNA苯酚 -氯仿抽提法 Rnase消化法 ？质粒 DNA和基因组 DNA的区别1. 大小不同2. 变性与复性有差异质粒 DNA较小，通常只有基因组 DNA分子量的百分之一。基因组 DNA容易断裂线性化。从大肠杆菌中分离质粒 DNA方法众多，目前常用的有： 依据宿主菌株类型、质粒分子大小、碱基组成及结构等特点选择。 碱变性法既经济且收得率较高 ,提取的质粒DNA可用于酶切 ,连接与转化。分离质粒 DNA和基因组 DNA的方法碱变性法煮沸法羟基磷灰石层析法等碱裂解法提取质粒的原理 应用最为广泛的制备质粒 DNA的方法。 基于染色体 DNA与质粒 DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。原理：1. 强碱 NaOH和 SDS裂解 细菌，细菌中的质粒 DNA和基因组 DNA在强碱条件下发生变性。2. 怎样去除基因组 DNA？当加入 酸 性物质进行 中和 时，质粒 DNA很快复性，而染色体 DNA则和变性蛋白质等缠绕在一起，难以复性，并形成沉淀，经过离心随细胞碎片一起去除。3. 怎样去除蛋白质？留有质粒 DNA的上清，经 酚 /氯仿去除蛋白质 后，用 乙醇沉淀 DNA，即得到质粒 DNA。三、试剂与仪器Biospin质粒 DNA小量提取试剂盒：Resuspension buffer, Lysis buffer, Neutralization buffer, wash buffer, Elution buffer, RNase solution, Spin columns.琼脂糖凝胶电泳：电泳仪，电泳槽，紫外灯琼脂糖， 50XTAE电泳缓冲液， 6X点样缓冲液， DNA Marker，溴化乙啶（荧光染料，结合 DNA并在紫外线下显示）四、操作步骤Resuspension Buffer 细胞悬浮液Lysis Buffer 碱裂解液Neutralization Buffer 中和液Spin column 吸附柱Wash Buffer 漂洗液Elution Buffer 洗脱缓冲液2. 质粒 DNA 的琼脂糖凝胶电泳1) 用胶带将洗净、干燥的配胶板的边缘封住，形成一个胶模并水平放置，放入电泳梳。2) 按水平板的长 宽 0.5cm胶厚，量取 1TAE，并按 0.8的浓度称 取琼脂糖（ agarose）， 在微波炉或电炉上加热至全熔（清澈透明）。3) 等凝胶温度降至大约 50 60 以下时，加入 1 mg/L溴化乙锭（ EB）至终浓度为 0.5g/mL ；摇匀并轻快地倒入水平板中，除掉气泡。4) 凝固后，将梳子轻轻拔出。5) 去掉胶带，将水平板放入加有 1TAE电泳缓冲液的电泳槽中，并且使电泳缓冲液高出凝胶约 1mm。6) 上样 Buffer 和 DNA 混匀后点样，记录点样