荧光免疫标记技术

任务任务 八八荧光免疫荧光免疫 标记技术标记技术知识目标知识目标技能目标技能目标素质目标素质目标1.重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在重点掌握免疫荧光显微技术、免疫荧光技术在医学检验中的应用医学检验中的应用2.熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器熟悉荧光的基础知识、荧光免疫分析常用仪器和设备和设备3.了解荧光抗体的制备了解荧光抗体的制备 1.会使用荧光显微镜等常用仪器和设备会使用荧光显微镜等常用仪器和设备2.会用荧光免疫技术检测抗原抗体会用荧光免疫技术检测抗原抗体3.能将荧光免疫测定与临床应用相联系能将荧光免疫测定与临床应用相联系 通过学生相互鼓励、严谨、认真操作，各小组共同通过学生相互鼓励、严谨、认真操作，各小组共同协作完成任务，培养了与人合作、与人沟通的能力协作完成任务，培养了与人合作、与人沟通的能力 任务目标任务目标1荧光标记物的制备2荧光免疫组织化学技术3其他荧光免疫技术任务对象任务对象任务过程任务过程 复习提问复习提问 案例导入案例导入讲解与示教讲解与示教学生操作学生操作讨论分析讨论分析评价、考核评价、考核课后思考题课后思考题 教教学学环环节节2302104051患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽患儿，男，间断发热五天，伴咳嗽 3天。体天。体温最高温最高 39度，病程第度，病程第 2天查血常规正常，诊天查血常规正常，诊断断 “ 呼吸道感染呼吸道感染 ” 并静滴并静滴 “ 阿奇霉素阿奇霉素 ” 3天天，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性，无明显改变，即而出现咳嗽，为阵发性刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理刺激性咳嗽，少痰，胸片提示：双肺纹理增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。增粗，右上肺片影。复查血常规仍正常。患儿肺部感染系哪种病原体所致？患儿肺部感染系哪种病原体所致？ 如何快如何快速诊断？速诊断？案例导入案例导入老师纠正老师纠正点评点评学生操作学生操作一位学生一位学生操作演示操作演示学生分组学生分组再操作再操作【 主要试剂与器材主要试剂与器材 】1.抗原基质片抗原基质片 固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切固定有核抗原，可采用小鼠肝组织切 片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。片或印片经丙酮固定即可。目前有商品化试剂供应。2.标记抗体标记抗体 FITC标记的羊抗人标记的羊抗人 IgG，有商品化试剂供，有商品化试剂供应。临用时稀释至工作浓度。应。临用时稀释至工作浓度。3.0.01mol/L pH7.2PBS。4.缓冲甘油缓冲甘油 9份甘油和份甘油和 1份份 PBS混匀。混匀。5.待检血清，阴性、阳性对照血清。待检血清，阴性、阳性对照血清。6.其它其它 荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。荧光显微镜、染色缸、吸管、微量加样器等。实验操作实验操作【 操作方法操作方法 】v1.自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈自冰箱中取出抗原基质片，平衡至室温，用记号笔画圈标记。标记。v2.将待检血清和对照血清用将待检血清和对照血清用 PBS作作 110稀释，用微量加稀释，用微量加样器加样器加 50l待检血清或对照血清于基质片上，水平置于待检血清或对照血清于基质片上，水平置于湿盒中湿盒中 37oC温箱反应温箱反应 30min。v3.以以 PBS冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有冲洗抗原基质片，再分别浸于盛有 PBS染色缸染色缸中，反复漂洗中，反复漂洗 3次，每次次，每次 5min。v4.取出玻片，吹干，加取出玻片，吹干，加 50l最适工作浓度的标记抗体，最适工作浓度的标记抗体，平置于湿盒内，平置于湿盒内， 37oC温箱反应温箱反应 30min。v 5.重复步骤重复步骤 3，洗去未结合的荧光抗体。，洗去未结合的荧光抗体。v6.滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。滴加缓冲甘油封片，用荧光显微镜观察。实验操作实验操作【 结果判断 】v1.荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；荧光显微镜下见肝细胞核呈黄绿色，为阳性；反之为阴性。反之为阴性。v2.根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：根据荧光分布情况，可分为四种荧光核型：v 均质型均质型 :细胞核呈均匀一致的荧光。细胞核呈均匀一致的荧光。v 周边型周边型 :细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或细胞核周围呈现荧光，核中央染色弱或无荧光。无荧光。v 斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。斑点型：细胞核呈现斑点状荧光。v 核仁型：核仁部分呈现荧光。核仁型：核仁部分呈现荧光。实验操作实验操作 实验操作实验操作【 注意事项 】 v1.滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片滴加的血清或标记抗体应充分覆盖满抗原片。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒。样品之间防止交叉污染。反应时应置于湿盒内，防止干燥。内，防止干燥。v2.每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。每次冲片应彻底，防止非特异荧光的干扰。v3.荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注荧光受温度影响较大，不能及时观察时应注意低温避光保存。意低温避光保存。实验操作实验操作【 应用与评价 】 v荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定荧光抗体技术应用较广，可用于病原微生物鉴定及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，及其抗体的检测；自身免疫病自身抗体的检测，免疫细胞表面抗原的检测等。免疫细胞表面抗原的检测等。v此方法检测此方法检测 ANA，主要用于初步筛查，具有简便，主要用于初步筛查，具有简便、快速、敏感等特点。、快速、敏感等特点。实验操作实验操作讨论分析讨论分析提提出出问问题题展展开开讨讨论论用什么可以用什么可以观察到荧光观察到荧光？为什么有荧为什么有荧光就能做出光就能做出诊断？诊断？免疫荧光技术（免疫荧光技术（ Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术。它是在免）又称荧光抗体技术。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。立起来的一项技术。v该技术的主要优缺点该技术的主要优缺点v主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。主要优点：特异性强、敏感性高、速度快。v主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解主要缺点：非特异性染色问题尚未完全解 决，决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。免疫荧光技术免疫荧光技术讨论分析讨论分析免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显免疫荧光技术是将抗原抗体反应的特异性和敏感性与显微示踪的精确性相结合。微示踪的精确性相结合。 以荧光素作为标记物，与已知的抗体以荧光素作为标记物，与已知的抗体 (或抗原或抗原 )结合、但结合、但不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试不影响其免疫学特性。然后将荧光素标记的抗体作为标准试剂，用于检测和鉴定未知的抗原。剂，用于检测和鉴定未知的抗原。在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗在荧光显微镜下，可以直接观察呈现特异荧光的抗原抗体复合物及其存在部位。体复合物及其存在部位。免疫荧光技术免疫荧光技术 - 基本原理基本原理讨论分析讨论分析荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引荧光是指一个分子或原子吸收了给予的能量后，即刻引起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一起发光；停止能量供给，发光亦瞬即停止。荧光素是一种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用种可吸收激发光的光便能产生荧光，并能作为染料使用的有机化合物，亦称荧光色素。的有机化合物，亦称荧光色素。发生原理发生原理 -基态基态 激发态激发态产生特点：激发产生特点：激发 -即刻产生即刻产生停止激发停止激发 -瞬间消失瞬间消失种类种类 -光致荧光，化学荧光，光致荧光，化学荧光， X线荧光，阴极射线荧光线荧光，阴极射线荧光讨论分析讨论分析荧光荧光寿命荧光寿命 -荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光物质被瞬时光脉冲激发后产生的荧光衰减到一定程度所用时间。荧光衰减到一定程度所用时间。荧光淬灭荧光淬灭 -荧光物质的荧光辐射能力在受到激发荧光物质的荧光辐射能力在受到激发光较长时间的照射后发生的减弱现象。光较长时间的照射后发生的减弱现象。淬灭剂淬灭剂 -苯胺、硝基苯、酚等苯胺、硝基苯、酚等荧光（标记）物质的保存荧光（标记）物质的保存荧光讨论分析讨论分析荧光色素荧光色素 :能够产生明显能够产生明显荧光并能作为染料使用荧光并能作为染料使用的有机化合物称为荧光的有机化合物称为荧光色素或荧光染料。用于色素或荧光染料。用于标记抗体的荧光色素，标记抗体的荧光色素，必须具有化学上的活性必须具有化学上的活性基因，能与蛋白质稳定基因，能与蛋白质稳定结合，且不影响标记抗结合，且不影响标记抗体的生物活性及抗原抗体的生物活性及抗原抗体的特异性结合。体的特异性结合。讨论分析讨论分析异硫氰酸荧光素异硫氰酸荧光素 (FITC)荧光荧光 FITC+RB200标记标记讨论分析讨论分析光源：高压汞灯、氙灯光源：高压汞灯、氙灯、卤素灯、卤素灯1 滤板：隔热滤板、激滤板：隔热滤板、激光滤板（光滤板（ UG、 BG）、吸收滤板（、吸收滤板（ OG、GG）2 光路：透射光、落射光路：透射光、落射光光荧光显微镜荧光显微镜讨论分析讨论分析a 透射光透射光 b 落射光落射光 讨论分析讨论分析荧光显微镜荧光显微镜 台式机台式机 -FACSCalibur双激光双激光 -488nm635nm四荧光参四荧光参数数分选、浓分选、浓缩系统缩系统讨论分析讨论分析大型机大型机 -FACSVantage SE多激光多多激光多波长八荧光波长八荧光参数高速分参数高速分选单细胞点选单细胞点对点分选对点分选讨论分析讨论分析v基本原理 -荧光显微镜；荧光 Ab；标本（组织或细胞中 Ag)v技术类型：直接法 -荧光素标记 Ab直接检测间接法 -荧光素标记二抗补体结合法 -荧光素标记抗补体 Ab双结合法 -两种荧光素标记 Ab重点荧光免疫显微技术讨论分析讨论分析讨论分析间接免疫荧光检测自身抗核抗体间接免疫荧光检测自身抗核抗体讨论分析讨论分析FALS SensorLaser前向角散射光（前向角散射光（ FSC）：反映细胞的大小）：反映细胞的大小荧光免疫显微技术荧