饲料中氨基酸的测定

饲料中氨基酸的测定黎观红江西农业大学动物科技学院6 饲料中氨基酸的测定 (教材 P106)l 氨基酸是组成蛋白质的基本结构单位，也是蛋白质的分解产物；l 蛋白质营养 氨基酸营养（不是很确切，小肽营养）；l 理想蛋白或理想氨基酸模式（畜禽日粮的氨基酸平衡理论） 饲料蛋白质营养价值评定。 6.1 概述6 饲料中氨基酸的测定氨基酸的分析测定饲料级氨基酸添加剂（单体制剂含量或纯度测定）饲料原料和配合饲料氨基酸含量的测定（蛋白质形式存在的、游离氨基酸含量） 通过酸水解、氧化酸水解和碱水解等处理方法将结合态氨基酸变成游离氨基酸 离子交换树脂、 HPLC测定 简单的化学分析 6 饲料中氨基酸的测定6.2 氨基酸饲料添加剂质量标准与检验饲料中氨基酸的测定 (教材 P120-131)6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换层析法）氨基酸自动分析仪： 主要由 日本（ Hitachi日立系列产品） 、美国（贝克曼（ Beckman）公司）、英国（安玛西亚公司）、德国（安米诺西斯公司）等国家生产。氨基酸测定 专用仪器 ，准确度高，设备昂贵。日立 L 8800氨基酸自动分析仪L-8900氨基酸自动分析仪的内部结构饲料中氨基酸的测定6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）（一）测定原理饲料中氨基酸的测定6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）（一）测定原理氨基酸的分离（离子交换树脂分离）：A、离子交换层析（ Ion Exchange Chromatography ）基本原理以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，以离子交换剂为固定相，特定的离子溶液为流动相，依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的 结合力不同结合力不同 进进行分离纯化的层析方式行分离纯化的层析方式 。饲料中氨基酸的测定A、离子交换层析基本原理离子交换剂由 基质基质 、 电荷基团电荷基团 （ 或称功能基团）和 反离子反离子 组成 。 基质一般是不溶性聚合物，如树脂树脂 ，纤维素，葡聚糖，醇脂糖，纤维素，葡聚糖，醇脂糖 等；等；纤维素纤维素 O CH2 COO- Na基质 电荷基团 反离子 树脂树脂 N+(CH3) OH-o RA+B RB A+(RA是是 阳离子交阳离子交换剂换剂 ， B为溶液中的离子或待分离的生物分子）为溶液中的离子或待分离的生物分子）A、离子交换层析基本原理当当 A+=B+,RBRA, 说明说明 R 与与 B 的结的结 合力比合力比 A 大；反之亦然。大；反之亦然。 对于两性蛋白而言，结合力取决于其对于两性蛋白而言，结合力取决于其 等电点以及等电点以及溶液的溶液的 pH值值 。饲料中氨基酸的测定1.平衡阶段 :离子交换剂与反离子结合。2.吸附阶段： 样品与反离子进行交换。3、 4. 解吸附阶段： 用梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，后洗下强吸附物质。5.再生阶段： 用原始平衡液进行充分洗涤，即可重复使用。1 2 3 4 5原始缓冲溶液的反离子样品溶液中的离子梯度液中的离子饲料中氨基酸的测定A、离子交换层析基本原理Ion-exchange chromatography（一）测定原理B、 氨基酸的分离（离子交换树脂分离）氨基酸：两性电解质，不同氨基酸电离常数各不相同。 pH、 pI 氨基酸的 pI从 2.77（天门冬氨酸）到 10.76（精氨酸）不等。大多在5 6之间。谷氨酸： 3.22；组氨酸： 7.59；赖氨酸： 9.74。 氨基酸的等电点 不同氨基酸对树脂的亲和力不同，其强弱顺序为：碱性氨基酸 芳香族氨基酸 中性氨基酸 酸性氨基酸及羟基氨基酸。6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）阴离子 两性离子 阳离子（ pHpI） （ pH=pI） （ pH 芳香族氨基酸 中性氨基酸 酸性氨基酸及羟基氨基酸 。u 提高流动相 pH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱上洗脱下来。 洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸 。u 氨基酸标准液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上 被洗脱的顺 序一定，标准液各种氨基酸的浓度一定 ，洗脱峰的面积一定，由此可计算出样品中各种氨基酸的含量。（一）测定原理B、 氨基酸的洗脱饲料中氨基酸的测定6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）（一）测定原理B、 氨基酸的洗脱用 pH递增的柠檬酸盐缓冲溶液洗脱 侧链 pKa增大的氨基酸o 分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。C、 氨基酸与茚三酮反应茚三酮反应 饲料中氨基酸的测定6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）（一）蛋白质的水解A、盐酸水解（常规或直接水解法）适用范围： 饲料原料、配合饲料、浓缩饲料中 除色氨酸、含硫氨基酸以外的 15种 氨基酸的 准确测定 。 （为什么是 15种？）样品加入 6 mol/L的 HCl溶液，真空封口，在 110 下水解 22 24 h，冷却后定容、过滤、蒸干。上机测定。 此过程中， 色氨酸 全部被破坏， 含硫氨基酸 被部分氧化损失，大约损失 20 30。加入巯基乙醇可部分保护蛋氨酸，提高测值 10 20天冬酰胺 谷氨酰胺 天冬氨酸 谷氨酸 饲料中氨基酸的测定6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）（一）蛋白质的水解B、氧化酸水解氧化水解法是将饲料蛋白中的含硫氨基酸 (胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸等 )用过甲酸氧化，然后进行酸解生成磺基丙氨酸和蛋氨酸砜，再经离子交换色谱分离、测定。本方法主要 适用于含硫氨基酸（胱氨酸和蛋氨酸） 的 准确分析 测定。此方法还可以测定 芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）及组氨酸 以外 的氨基酸。n 水解中色氨酸破坏，不能测定。n 酪氨酸在以偏重亚硫酸钠做氧化终止剂时，被氧化，不能测准。n 酪氨酸、苯丙氨酸和组氨酸则在以氢溴酸作终止剂时被氧化，不能测准。 饲料中氨基酸的测定6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）（一）蛋白质的水解C、碱水解本方法适用于饲料原料、配合饲料和浓缩饲料中 色氨酸 的测定。饲料蛋白在 110 ，碱的作用下水解，水解出的色氨酸可用离子交换色谱或高效反相色谱分离、测定。另：分光光度法测定饲料中的色氨酸：饲料中蛋白质经碱水解后，降解成多肽和游离的氨基酸，在酸性介质中，氧化剂存在下，色氨酸吲哚环与对 二甲氨基苯甲醛 反应生成蓝色化合物，在一定范围内颜色深浅与色氨酸含量成正比。 饲料中氨基酸的测定6.3 氨基酸自动分析仪法（离子交换树脂法）（一）蛋白质的水解D、酸提取法n 酸提取