药敏试验ppt课件

实验十一 细菌的药敏实验及耐药表型检测实 验 目 的 一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素 “ 敏感” 。反之，则称为 “ 不敏感 ” 或 “ 耐药 ” 。为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药，减少盲目性，往往应进行药敏试验。实 验 方 法药物敏感试验目前常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩散法（ K-B法）、稀释法、 E试验、检测细菌耐药性的方法。稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。检测细菌耐药性的方法包括 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（ MRSA）的检测、耐万古霉素肠球菌（ VER）的检测、耐青霉素肺炎链球菌（ PRP）的检测、超广谱 - 内酰胺酶（ ESBL）的检测和 - 内酰胺酶的检测。药物敏感试验药敏试验方法纸片琼脂扩散法（ K-B法）、稀释法稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。检测细菌耐药性的方法超广谱 - 内酰胺酶（ ESBL）的检测- 内酰胺酶的检测实 验 方 法平板扩散法1 可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌 混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密2 将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般每个平皿贴 4片，每种药敏片的名称要记住。 3将平皿培养基置于 37 温箱中培养 24小时后，观察效果。 平板扩散法4 抑菌环直径测量：以肉眼观察没有明显菌苔生长的边缘为界，用的卡尺量取抑菌环直径。变形杆菌在抑菌环内生长的薄菌苔可忽略不计。复方新诺明抑菌环内会有轻微细菌生长，小于 20左右可忽略不计。 5 结果报告：，抑菌环直径的大小可以反应 MIC值的高低。因此根据抑菌环直径的大小可以参照稀释法 MIC值的判断标准报告敏感、耐药和中介。常量肉汤稀释法1.抗菌药物贮存液制备 抗菌药物贮存液浓度不应低于 1000g/ml( 如 1280g/ml) 或 10倍于最高测定浓度。溶解度低的抗菌药物可稍低于上述浓度。抗菌药物直接购自厂商或相关机构。常量肉汤稀释法2.药敏试验用抗菌药物浓度范围 根据 NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，药物浓度范围应包含耐药、中介和敏感分界点值，特殊情况例外。 3. 培养基 NCCLS推荐使用 Mueller-Hinton（ MH）肉汤， pH7.27.4。需氧菌及兼性厌氧菌在此培养基中生长良好。在测试葡萄球菌对苯唑西林的敏感性时，应在肉汤中加入2%（ W/V）氯化钠，按制造厂家的要求配制需要量的 MH肉汤。常量肉汤稀释法4.接种物的制备 直接 菌落 悬液配制法，直接取培养 1824h的菌落调配成 0.5麦氏比浊标准的菌悬液。用 MH肉汤将上述菌悬液进行1100 稀释后备用。注意应在 15分钟内接种完配制好的接种物。 E、附： 0.5麦氏比浊管配制方法 0.048M BaCL2 (1.17% W/V BaCL2 . 2H2O) 0.5ml 0.36N H2SO4 (1%, V/V) 99.5ml 将二液混合，置螺口试管中，放室温暗处保存。用前混匀。 有效期为 6个月。 F、稀释抗菌药物的制备及菌液接种 1.1.5.稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（ 13100mm ） 13支，排成一排，除第 1管加入 1.6mlMH肉汤外，其余每管加入MH肉汤 1ml，在第 1管加入抗菌药物原液（如1280g/ml ） 0.4ml混匀，然后吸取 1ml至第 2管，混匀后再吸取 1ml至第 3管，如此连续倍比稀释至第 11管，并从第 11管中吸取1ml弃去，第 12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为 256、 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25g/ml 。然后在每管内加入上述制备好的 接种物 各 1ml，使每管最终菌液浓度约为 5105CFU/ml 。第 1管至第 11管药物浓度分别为 128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 05、 0.25、0.125g/ml 。 G、孵育 1.1.6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置 35 普通空气孵箱中孵育 1620h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育 2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满 24h。 H、结果判断与解释 1.1.7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的 MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查 接种物 的传代培养 情况以确定其是否污染，质控菌株的 MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的 MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌 MIC。在临床微生物学检验中，麦氏比浊法常用于细菌鉴定、药敏实验前配置菌液时大致判断菌液浓度的一种方法，通常认为，如将配菌液浓度配成 0.5麦氏比浊管时，相当于1.5108 细菌数 /ml，由于方法本身就是一种估计的方法，所以尽管不同细菌大小差异很大，除了真菌孢子，细菌的差别不大，结果不会有影响。但是，标准比浊管的浓度，是药敏实验结果的影响因素之一。常量肉汤稀释法5. 稀释抗菌药物的制备及菌液接种 取无菌试管（13100mm ） 13支，排成一排，除第 1管加入 1.6mlMH肉汤外，其余每管加入 MH肉汤 1ml，在第 1管加入抗菌药物原液（如 1280g/ml ） 0.4ml混匀，然后吸取 1ml至第 2管，混匀后再吸取 1ml至第 3管，如此连续倍比稀释至第11管，并从第 11管中吸取 1ml弃去，第 12管为不含药物的生长对照。此时各管药物浓度依次为 256、 128、 64、32、 16、 8、 4、 2、 1、 0.5、 0.25g/ml 。然后在每管内加入上述制备好的接种物各 1ml，使每管最终菌液浓度约为 5105CFU/ml 。第 1管至第 11管药物浓度分别为128、 64、 32、 16、 8、 4、 2、 1、 05、 0.25、0.125g/ml 。常量肉汤稀释法 6.孵育 将接种好的稀释管塞好塞子，置35 普通空气孵箱中孵育 1620h；嗜血杆菌和链球菌在普通空气孵箱中孵育 2024h；对可能的耐甲氧西林葡萄球菌和耐万古霉素肠球菌应持续孵育满 24h。常量肉汤稀释法 7.结果判断与解释 在读取和报告所测试菌株的 MIC前，应检查生长对照管的细菌生长情况是否良好，同时还应检查接种物的传代培养情况以确定其是否污染，质控菌株的MIC值是否处于质控范围。以肉眼观察，药物最低浓度管无细菌生长者，即为受试菌的MIC。甲氧苄胺嘧啶或磺胺药物的肉汤稀释法终点判断，与阳性生长对照管比较抑制80%细菌生长管药物浓度为受试菌 MIC。琼脂稀释法 介绍 琼脂稀释法是将不同剂量的抗菌药物，加入融化并冷至 50 左右的定量 MH琼脂中，制成含不同递减浓度抗菌药物的平板，接种受试菌，孵育后观察细菌生长情况，以抑制细菌生长的琼脂平板所含最低药物浓度为 MIC。本法优点是可在一个平板上同时作多株菌 MIC测定，结果可靠，易发现污染菌；缺点是制备含药琼脂平板费时费力。琼脂稀释法培养基制备 2.1.培养基制备 使用 MH琼脂，按商品说明书进行配制， pH7.27.4。淋病奈瑟菌使用GC琼脂基础加 1%添加剂；其它链球菌使用含 5%（ V/V）绵羊血的 MH琼脂（当试验磺胺药时，使用溶解的马血）。 2.2.含药琼脂平板制备 根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抗菌药物分别加入已加热溶解，并在 4550 水浴中平衡的MH琼脂中，充分混匀倾倒灭菌平皿，琼脂厚度 34mm。通常按 19 比例配制药物琼脂平板，根据需要来选择药物浓度范围。配制好的含药琼脂平板应装入密封塑料袋中，置 28 冰箱可贮存 5天。琼脂稀释法 2.3.接种物制备与接种 制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，再 110 稀释，以多点接种器吸取制备好菌液（约12l ）接种于琼脂平板表面，每点菌数约为 104CFU，形成直径为 58mm的菌斑。接种好后置 35 孵育 1620h。琼脂稀释法 2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制 80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。琼脂稀释法 2.4.结果判断 将平板置于暗色、无反光物体表面上判断试验终点，以抑制细菌生长的最低药物浓度为 MIC。在含甲氧苄胺嘧啶或磺胺琼脂平板上可见轻微细菌生长，与生长对照比较抑制 80%以上细菌生长的最低药物浓度作为终点浓度。琼脂稀释法实 验 方 法AmpC酶 AmpC 酶是 AmpC内酰胺酶的简称。 是由肠杆菌科细菌或和绿脓假单胞菌的染色体或质粒介导产生的一类 内酰胺酶 ,属 内酰胺酶 Ambler 分子结构分类法中的 C 类和 Bush Jacoby Medeiros 功能分类法中第一群，即作用于头孢菌素、且