间接免疫荧光法测ana

间接免疫荧光法检测抗核抗体 （ ANA）制作人： XXX20XX-XX-XX抗核抗体n 【 自身抗体 】 ：指抗自身组织、器官、细胞及其成分的抗体n 【 ANA】 ：指抗细胞核成分（ DNA， RNA，蛋白质和酶）的抗体。 ANA存在一个谱n ANA新概念：抗核酸（ Nucleic acid）和核蛋白（ Nucleoprotein）抗体的总称n 某些核抗原成分在核仁和胞浆内比核质内更丰富ANA检测的意义n 有助于疾病的诊断如抗 Sm是 SLE标记抗体；抗 ScL-70 是 SD的标记抗体；抗 Jo-1是 PM/DM的标记抗体 ；n 观察疾病活动度和治疗反应n 研究发病机理【 ANA分类 】n抗 DNA（ dsDNA,ssDNA)n抗组蛋白（ Histone)n抗非组蛋白（ Nonhistone,Extractable Nuclear Antigen, ENA）n抗核仁（ Nucleolus）几种 ENA的由来及同义词n Sm： 病人名： Smithn RNP: u1 RNP或 nRNP Nuclear Ribonucleoproteinn SSA: RO Sjogrens syndrome An SSB: La, Ha, Sjogrens syndrome Bn Jo-1: 病人 Johnn ScL-70: Scleroderma【 ANA 由 来 】中性粒细胞 DNP(DNA-Histone)+抗 DNP+补体均质体LE细胞LE细胞：并非 SLE特有， PM、 SD、 RA、 SS等结缔组织病，药物过敏，慢活肝等亦可阳性。抗 DNP取代 LE细胞的检测+ANA的筛选：间接免疫荧光法+ +抗原 抗体（血清） 抗原 抗体 第二抗体ANA的筛选：间接免疫荧光法实验原理：生物薄膜载片 上的 IgA、 IgG、 IgM类 特异性抗体 可以与 抗核抗原 反应；随后，结合抗体可与 标记荧光的二抗 进行反应，并可在荧光显微镜下观察。抗原人特异性抗体FITC标记的抗人抗体FITCFITC载片实验原理：生物薄片马赛克 TM技术【 实验步骤 】实验步骤一：准备p检查加样板是否反应区亲水而周边疏水？如果不是，可用湿纸巾擦拭，必要时可使用家用洗涤剂，再用水彻底冲洗。需要消毒时，可于 3的 Sekusept Extra （汉高公司）中浸泡 1小时。p只有当载片平衡到室温后方可打开袋子。不要触及生物薄片。按照要求用记号笔对玻片进行标记。实验步骤二：样品准备l1:100稀释血清标本。每次实验均需加入阳性和阴性对照。对照血清使用前必须混匀。 实验步骤三：加样n 在加样板的每个反应区加入稀释血清， 避免产生气泡 。滴加完所有待测标本后才 开始温育 。使用聚苯乙烯加样板。n 加样体积 : 25 l/反应区 (5 x 5 mm)1 2 3 4 5样品 1 样品 2 样品 3 阳性对照 阴性对照实验步骤四：孵育n 将载片盖在加样板对应的凹槽里，反应即开始。 确保每个标本均能够与生物薄片相接触 ，而 标本之间不相互接触 。室温（ 18-25 ）温育 30分钟 。实验步骤五：冲洗n 用烧杯盛 PBS-Tween缓冲液， 流水 冲洗载片，然后 立即 放入装有 PBS-Tween缓冲液的小杯中浸洗 至少 5分钟 。实验步骤六：加样n 将 20l荧光标记的抗人球蛋白 （荧光二抗）加入 洁净加样板 的每个反应区。 完全加完所有的二抗后 ， 方可继续温育 （最多可加 50个载片）。 建议使用连续加样器 。加样前应使用加样器 混匀 。 为节约时间，可在第一步温育的同时滴加酶结合物至另一个加样板的反应区中。实验步骤七：孵育n 从 PBS-Tween 清洗缓冲液中 取出一张载片， 5秒钟 内用吸水纸擦一下背面和边缘后，立即 将载片覆有生物薄片的一面朝下，盖在加样板的凹槽里。n 注意：为防止破坏基质， 不要擦拭反应区的间隙。n 检查生物薄片是否与液滴接触良好，然后继续下一张。n 从现在开始，注意避免阳光直射载片。n 室温温育 30分钟 。 实验步骤八：冲洗n 用烧杯盛 PBS-Tween缓冲液， 流水 冲洗载片，然后 立即 放入装有 PBS-Tween缓冲液的小杯中 浸洗至少 5分钟 。n 可在每 150ml磷酸盐缓冲液 中加 10滴 (150 l)伊文氏蓝 进行 复染 。实验步骤九：封片n 在 盖玻片 上滴加 甘油 /PBS。n 封片体积 : 10 l/反应区 (5 x 5 mm)n 从 PBS-Tween 清洗缓冲液中 取出一张载片，用纸 擦干 背面和四边， 注意不要擦拭反应区间隙。n 将载片的生物薄片朝下置于准备好的盖玻片上，立即检查盖玻片是否放入载片的凹槽里，如有必要，需调整位置，正确放置。n 然后再进行下一个载片的操作。实验步骤十：结果判断荧光显微镜下观察荧光。 结果判读：n 荧光显微镜下观察n 细胞核发 黄绿色荧光 为 阳性 染色细胞， 不发荧光 为 阴性 。n 抗原片中出现阳性染色细胞为 ANA阳性，否则为阴性。n 阳性待检血清可作进一步稀释后测定效价。【 均质型 】细胞核呈均匀一致的荧光【 核仁型 】核仁部分呈现荧光【 斑点型 】 (颗粒型 )细胞核内呈现斑点状荧光【 胞浆型 】【 着丝点型 】混合型：存在两种以上的类型混合型：存在两种以上的类型ANA结 果判断1： 100 阴性 阴性， 标 本中未 检测 到抗核抗体1：