课件基因工程的基本操作程序

第二节 基因工程的原理和技术问题：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？1 获得人的 胰岛素 基因 目的基因的获取 2 将目的基因转移入大肠杆菌（ 1）将 人的 胰岛素 基因 拼接到大肠杆菌的质粒中 形成重组 DNA分子 （ 2） 将重组质粒导入到大肠杆菌中？ 将 重组 DNA分子 导入受体细胞 （ 3）人的 胰岛素 基因导入成功了吗？ 筛选含有目的基因的受体细胞 3 大肠杆菌能合成人的 胰岛素4 目的基因的表达 获取重组导入检测表达一、目的基因的获取 （ 获得人的 胰岛素 基因）DNA的粗提取1、从基因文库中获取目的基因：(通常在未知 DNA序列的情况下 )基因组文库的构建：cDNA文库的建立：基因文库基因文库 ：基因组文库基因组文库 ：包含该生物的所有基因。cDNA文库文库 ：包含该生物的部分基因。一般针对基因的编码区而建立。2、体外直接合成目的基因(通常在已知 DNA序列的情况下 ) 利用 PCR技术扩增目的基因变性退火延伸A PCR全称为 _。 C 条件： _、 _ 、 _ 、 _。B 原理： _D 结果： _聚合酶链式反应DNA复制已知序列的目的基因四种脱氧核苷酸三磷酸一对引物DNA聚合酶使目的基因短时间内呈指数方式扩增E 过程： _高温变性、低温退火、中温延伸由已知氨基酸序列推测可能的 DNA序列 利用 DNA合成仪化学合成合成较小的基因（不超过几十个碱基）例：核酸分子杂交的探针， PCR扩增的引物等。DNA合成仪 利用 DNA合成仪化学合成运载体限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶15C重组运载体运载体自连目的基因自连AATTCG目的基因AATTCGGCTTAAGCTTAAGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG二、形成重组 DNA分子 （ 将人的 胰岛素 基因拼接到大肠杆菌的质粒中）重组 DNA分子一定能使目的基因表达吗？ 重组 DNA分子的组成：目的基因、标记基因、 启动子、终止子、复制原点 参与的工具酶：限制性核酸内切酶、 DNA连接酶二、形成重组 DNA分子三、 将重组 DNA导入受体细胞（ 将重组质粒导入到大肠杆菌中）导入微生物细胞：用 Ca2+处理受体细胞，将重组 DNA与之混合；导入植物细胞： 土壤农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法等导入动物细胞： 对受精卵进行显微注射、胚胎干细胞技术、精子载体法等土壤农杆菌法花粉管通道法基因枪法例：用携带外源基因的农杆菌 Ti质粒转化植物细胞，使外源 DNA与植物染色体 DNA整合，通过培养形成愈伤组织，最后发育成转基因植物。目的基因导入动物细胞如：显微注射法动物细胞受精卵显微注射法例： 从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物 tPA。同样方法可获得 疫苗、生长激素等。四、筛选含有目的基因的受体细胞（人的 胰岛素 基因导入成功了吗）DNA分子杂交技术：抗药性筛选法：互补显色筛选法：原核营养缺陷性筛选法： 载体分子携带营养成分（氨基酸，核苷酸）的生物合成基因，受体细胞基因突变，不能合成营养物质。两者构成营养缺陷。 在缺少营养物质的培养基上受体细胞不存活，存活的是导入成功的受体细胞。五、目的基因的表达 （ 大肠杆菌能合成人的 胰岛素吗）1、分子水平检测：检测转基因生物的 DNA是否插入目的基因（即检测导入是否成功）检测目的基因是否转录出了 mRNA： 分子杂交技术检测目的基因是否翻译成蛋白质： 提取蛋白质、抗原 -抗体杂交2、个体水平检测： 检测性状 总结：如何使大肠杆菌生产出人的胰岛素？以大肠杆菌为宿主菌进行基因的克隆 将目的基因克隆到大肠杆菌细胞中的操作步骤： 1获得目的基因（和质粒载体）； 2形成重组质粒； 3制