实验六质粒dna的制备课件

实验六 碱变性法小量制备质粒 DNA 一实验目的 w 掌握碱变性裂解法制备质粒 DNA的原理。 w 掌握 DNA分离纯化的基本操作技能。 二实验背景 质粒是细菌染色体外的环形双链 DNA分子，能在宿 主细胞内独立自主的进行复制。 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合环状的 分子，以超螺旋形式存在。它是细菌内的共生型 遗传因子。大小可从 1kb到 200kb。 The constructed E. coli plasmid pBR322. 质粒的复制和转录要依赖于宿主细胞编码的某 些酶和蛋白质，如离开宿主细胞则不能存活， 而 宿主 即使没有它们也可以正常存活。 质粒的存在使宿主具有一些额外的特性，如对 抗生素的抗性或致育因子等。 Relaxed circle Linearized form Super-coiled form 质粒类型 质粒按复制方式分为两种类型： 松弛型质粒 和 严紧型质粒 w 松弛型质粒 其复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿 主提供的半衰期较长的酶。质粒的拷贝数通常很高，有 的甚至可达 2000-3000拷贝 /细胞。 2.严紧型质粒 严紧型质粒的复制受到严格控制，其拷贝数通常很低， 每个细胞内只含有 1 个或几个质粒分子 。 质粒的应用 大多数基因工程使用松弛型质粒。 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受毒害致死 的基因。 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩 增或表达的重要媒介物， 这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值 。 -四个载体酶切图 分离质粒 DNA方法 从大肠杆菌中分离质粒 DNA方法众多，目前常用的有 ： 碱变性法； 煮沸法； 羟基磷灰石层析法等 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分子大小、 碱基组成及结构等特点加以选择的，其中碱变性法既经 济且收得率较高 ,提取的质粒 DNA可用于酶切 ,连接与转 化。 差速离心（ differential centrifugation） 是利用不同离心速度产 生的不同离心力，将沉降系数不同的各种亚细胞组分和各种颗粒分开 。 用于分离 大小、形状显著不同 的组分，根据颗粒沉降速度不同得以分 离 . 特点： （ 1）介质密度均一； （ 2）速度由低向高，逐级离心。 沉降顺序：核 线粒体 溶酶体与过氧化物酶体 内质网与高 尔基体 核蛋白体。 可将大小相差悬殊的细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯度离心 再行分离纯化。 差速离心 dx 2r2 ( p- m) V= = . 2 X dt 9 d2 ( p- m) = . 2 X 18 r： 球形粒子的半径 d： 球形粒子的直径 ： 流体介质的粘度数 p： 粒子的密度 m： 介质的密度 沉降系数沉降系数 Sedimentation coefficient (S) S在实际应用时常在在实际应用时常在 10-13秒左右，故把秒左右，故把 沉降系数沉降系数 10-13秒称为一个秒称为一个 Svedberg单单 位，简写位，简写 S，量纲为秒。，量纲为秒。 S是指单位离心场中粒子移动的速度。是指单位离心场中粒子移动的速度。 差速离心 高速 低速 三、实验原理 碱变性法基本原理 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒 DNA的方 法，碱变性抽提质粒 DNA是基于染色体 DNA与质粒 DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。 在 pH值高达 12.6的碱性条件下，染色体 DNA的氢键 断裂，双螺旋结构解开而变性。质粒 DNA的大部分 氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补 链不会完全分离， 当以 pH4.8的 NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其 pH值 至中性时，变性的质粒 DNA又恢复原来的构型， 保存在溶液中，而染色体 DNA不能复性而形成缠 连的网状结构， 通过离心，染色体 DNA与不稳定的大分子 RNA、蛋 白质 SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。而 质粒 DNA仍为可溶状态留在上清中。 四、操作步骤 分离质粒 DNA的方法一般包括 3个基本步骤： 培养细菌使质粒扩增； 收集和裂解细菌； 分离和纯化质粒 DNA。 思考题