荧光定量pcr技术讲座0515ppt课件

实时荧光定量 PCR技术的 原理、应用及实践 (Real time Quantitative PCR)Real time Quantitative PCR 基 本 原 理 Company name 基本原理 Company name Real-time qPCR的定量原理2 Real-time qPCR的检测方法3 Real-time qPCR的基本概念1 Real-time qPCR的解析方法4 Real-time qPCR的计算方法5 Real-time qPCR的定义 Company name 实时荧光定量 PCR技术： 利用 荧光信号 的变化实时检测 PCR扩增反应中 每一个循环扩增产物量的变化，通过 Ct值 和 标准 曲线 实现对 起始模板 的定量分析。 Real-time PCR仪 ABI7500 PCR：基本原理 Denaturation: 94 96C Annealing: 50 65C Extension: 70 75C 基本要素： Template Primers DNA polymerase dNTP, N=A,G,C or T Company name 与普通 PCR的比较 S形曲线，具有平台效应 终点检测法 反应效率差异的累积使 终点定量几乎不可能 不同浓度的起始模板经 PCR扩增后到达 某一定 值时 所需要的 循环数 来 计算起始模板量 定量原理 Company name 理想的 PCR反应： X=X0*2n 实际的 PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第 n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率 定量原理 在扩增产物达到阈值线时 : XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量 . 在阈值线设定以后 ,它是一个常数 ,我们设为 M 方程式 (1)两边同时取对数得 : log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式 (2)得 : log X0= - log(1+Ex) Ct+ log M (3) log(1+Ex) Ct=- log X0 + log M Ct=-klogX0+b Company name Company name 每个模板的 CT 值 与该模板的起始拷贝数 的对数存在线性关系， 起始拷贝数越多， CT 值越小。 确定初始模板的浓度 定量原理 Ct=-klogX0+b real-time qPCR 使确定模板初始数量成为可能 11 实时荧光定量 PCR中的三个概念 1 扩增曲线 (primary curve) 2 荧光阈值（ threshold) 3 CT 值 (Cycle Threshold) 扩增曲线 (primary curve) Company name 荧光基团 荧光检测元件 扩增曲线：随着 PCR反应的进行，扩增产物不断累积 ，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一 次荧光强度信号，得到一条荧光增长曲线图 横坐标：扩增循环数（ Cycle）；纵坐标：荧光强度 Company name 荧光阈值（ threshold) 是在扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在 PCR反应指数扩增阶段任意位置上，但一般荧光域值 的缺省设置是 PCR反应前 3-15个循环荧光信号标准偏 差的 10倍。 阈值线 原则： 1）要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 ； 2）同时要尽量选择进入 指数期 的最初阶段 CT 值 (Cycle Threshold) Company name Ct值的定义 ： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定 的阈值时所经过的扩增 循环次数 C(t) value Company name Ct值的特点 ： 相同模板进行 96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性 检测方法 Company name 非特异性荧光标记： SYBR Green I 特异性荧光标记： 水解探针： TaqMan 非水解探针： Molecular beacon 17 解析方法 2 标准曲线分析 1 融解曲线分析 3 绝对定量和相对定量 Company name 将温度对荧光强度的变化求导。将温度对荧光强度的变化求导。 (-dI/dT) Tm值 确认 PCR反应的特异性 融解曲线分析 Company name 融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确 融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确 融解曲线分析 Company name 初始模板量的对数与循环数（ Ct值）呈线性关系，就可以制 作以起始拷贝数的对数为横坐标， Ct值为纵坐标的 标准曲线 。 荧光强度 -循环数曲线 初始模板量对数 -C(T)循环数标准曲线 .未知 104 103 106 105 102 10 标准曲线分析 计算样品的起始拷贝数 已知基因拷贝数的标准品建立标准曲线 关键： DNA的精确定量 绝对定量 Sample 25 22 相对定量相对定量 表达量 校正样品量 内参 beta-actin、 GAPDH基因、 rRNA等看家基因 在细胞中的表达 量或在基因组中 的拷贝数恒定， 受环境因素影响 较小 目的基因 /内标基 因，均一化为每 个细胞或基因组 对应的目的基因 数量 以各自样本中内参基因为标准，比较不同样本中目的 基因的相对表达丰度 23 相对定量的数据处理 Ct Ct Pfaffl Modification Vandesompele Method 非均一化的 需要后续的 均一化 以内参基因作为 标准 目标样品的相对 定量通过内参基 因的相对定量进 行均一化 只有一个内参基 因 假设扩增效率为 100% 扩增效率不 同 只有一个内 参基因 扩增效率不 同 多个内参基 因 简单 复杂 比较 Ct法 2 -Ct Fold induction = 23 = 8 Company name sample 内参 目的基因 Tissue #1: 21 22 Tissue #2: 20 24 1st Delta Ct #1: 22-21 = 1 Ct #2: 24-20 = 4 2nd Delta Ct: 4-1 = 3 相对定量方法 Ct存在的问题 Company name 成立条件：假设扩增效率为 100% 满足条件： 1）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率为 90%-110% 相对定量方法 实 验 流 程 Company name 应 用 v定量 基因表达水平检测 v定量 基因拷贝数检测 v多色标记 SNP检测 v高精度溶解曲线分析（ HRM） - SNP v高精度溶解曲线分析（ HRM） - DNA甲基化分析 基因表达水平检测 Company name 样本处理 RNA提取 qPCR 数据分析 实 验 流 程 逆转录 样本处理与 RNA提取 v外界刺激 可检测的表达改变 v样品离开定义环境 裂解、固定细胞 Trizon 裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） 液氮 RNA保存液 v小心 DNA污染！ 使用 DNase 以 RNA作 PCR阴性对照 CW0580 CW0592 逆转录 逆转录引物选择 下游应用：是否检测其它基因？ Abundant RNA的干扰： mRNA or total RNA？ 检测灵敏度是否足够？ 是否会有二级结构干扰？ 一步法还是两步法？ 两步法： 步骤多但灵活多样。 cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段 RealSYBR 二步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROX RealSYBR 一步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROX RealSuper 二步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROX 一步法： 简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 RealSuper 一步法荧光定量 PCR试剂盒 /With ROX Master mix的优化 vHotstar 化学修饰，低温下酶活抑制强，热复活需 10分钟 vFast Hotstar 抗体或 oligo修饰，热复活仅需 几十秒 CW0696 CW0704 热启动 DNA聚合酶 反应条件优化 内参基因 单一特异性产物 反应效率 90%-110% 反应条件优化 目的基因 单一特异性产物 反应效率接近内参基因 反应效率尽量高 内参基因内参基因 高丰度 ACTB， GAPDH 中等丰度 beta2M 低丰度 HPRT1 36 扩增产物设计原则 二级结构 颈环结构 片段长度 75-200bp 最佳长度 80-120bp 有限的二级结构 二级结构的预测 用 mFold http:/bioinfo.m /mfol d/applications 引物避免位于颈 环结构上 总原则与普通 PCR相同 二级结构 Company name v扩增产物的二级结构 引物避免位于颈环结构上 Company name 引物的位置 Company name 55 60 65 温度对二级结构的影响 Company name 实 践 Company name 实 践 内参基因的标准曲线的 绘制与数据分析 Company name 样本： 293T细胞株 人 提取方法： Trizon RNA 提取试剂 CWBIO 公司 CW0580说明书 2106 个细胞总 RNA 琼脂糖凝胶电泳图 RNA提取 Company name 逆转录： HiFi-MMLV cDNA 第一链合成试剂盒 CWBIO 公司 CW0744说明书 取 5ul扩增产物，用 1.7%琼脂糖凝胶进行电泳 体系： 2 TaqMasterMix 10ul GAPDHF引物（ 10um） 0.5ul GAPDHR引物（ 10um） 0.5ul cDNA 1u 加入灭菌水至 20 ul。 逆转录 Company name 模板 cDNA 模板稀释倍数 10000倍 1000倍 100倍 10倍 引物 内参基因引物 模板 反应体系的配置 cDNA 模板 2.0l 正向引物 F(10M) 0.5l 反向引物 R (10M ） 0.5l REALSYBR Mixture(2) 10.0l ddH2O 7.0l Total 20.0l Company name 注意： 1、为了避免加样误差，做预混体系 2、充分混匀，如有气泡短暂离心 Company name 1. 95 5min 2. 95 10-15sec 3. 60 20-30sec 4. Plate read 5. Go to 2 for 39 cycles more 6. Melting curve analysis: from 72 to 95 , read every 0.2 , hold 1sec between reads End Tm值：值：