【毕业学位论文】（Word原稿）芽胞杆菌脂肪酸生物标记测定条件的异质性研究

分类号： 单位代码： 10389 密 级： 学 号： 1091730 福建农林大学硕士学位论文 芽胞杆菌脂肪酸生物标记测定条件的异质性研究 学 科 门 类：理学 一级学科名称：生物学 二级学科名称：微生物学 研 究 方 向：应用微生物学与基因工程 研 究 生：王子旋 指 导 教 师：刘 波 研究员 林营志 副研究员 完 成 时 间：二 月 he of gy h gy i o 2012 4 独创性声明 本人声明，所呈交的学位（毕业）论文，是本人在指导教师的指导下独立完成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谢意，如被查有侵犯他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位（毕业）论文的规定，即学校有权送交论文的复印件，允 许论文被查阅和借阅 ; 学校可以公布论文的全部或部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在 年后解密可适用本授权书。 不保密，本论文属于不保密。 学位（毕业）论文作者亲笔签名： 日期： 指导教师亲笔签名： 日期 福建农林大学硕士学位毕业论文 i 目录 中文摘要 . 1 . 2 第一章 引言 . 3 1、芽胞杆菌的分类 . 3 1. 1 经典分类 (表型特征 )(. 3 1. 2 分子分类法 (. 4 1. 3 化学分类 (. 4 2、磷脂脂肪酸的概述 . 5 脂脂肪酸发展史 . 5 肪酸原理 . 6 肪酸分析方法 . 6 肪酸种类 . 6 肪酸检测方法 . 6 肪酸命名 . 7 肪酸在微生物研究中应用 . 8 第二章 芽胞杆菌菌株收集与保藏 . 12 1、引言 . 12 2、材料与方法 . 12 料和仪器 . 12 验方法 . 13 3、结果与分析 . 15 胞杆菌菌落形态描述 . 15 空冷冻干燥保藏菌株质量检查 . 22 干保藏前和保藏后的菌落形态 . 23 4、讨论 . 24 第三章 芽胞杆菌脂肪酸提取条件的异质性 . 26 1、引言 . 26 2、材料与方法 . 26 料与仪器 . 26 验方法 . 27 3、结果与分析 . 27 定系统重复性验证试验 . 27 同获菌量对 定结果的影响 . 29 同皂化时间对 定系统的影响 . 31 化试剂不同用量对 定系统的影响 . 32 基化试剂不同用量对 定系统的影响 . 34 4、讨论 . 35 第四章 影响芽胞杆菌脂肪酸种类鉴定的因素 . 37 1、引言 . 37 2、材料与方法 . 37 料与仪器 . 37 验方法 . 39 3、结果与分析 . 39 同获菌量对 测结果的影响 . 39 同培养时间对 测结果的影响 . 50 同培养温度对 测结果的影响 . 61 同获菌量、培养时间和培养温度对芽胞杆菌脂肪酸种类的影响 . 69 同获菌量、培养时间和培养温度对芽胞杆菌脂肪酸含量的影响 . 72 9 株模式芽胞杆菌的最适鉴定条件 . 74 4、讨论 . 75 第五章 总结与展望 . 78 1、结论 . 78 2、特色 . 78 参考文献 . 79 个人简历 . 85 致 谢 . 87 福建农林大学硕士学位毕业论文 1 中文摘要 对 39 种 芽胞杆菌模式菌株进行活化，扩繁后利用真空冷冻干燥保藏法对其进行保藏。 定期 对保藏菌株进行活性检测，结果证明，菌株的活性较好均可达到 109 个数量级，无杂菌污染 ， 且菌落形态与保藏前一致， 说明 真空冷冻干燥保存法是一种较好的保藏方法。 用 枯草 芽胞杆菌和 苏云金芽胞杆菌 对 生物 鉴定系统重复性和准确性进行验证 ，结果证明， 定系统的准确性和重复性 均 较好 。 每 种 菌的 8 个重复都可准确鉴定到种，且鉴定结果的相似性系数相差都在 内。同时对影响脂肪酸提取的因素进行研究发现，当获菌量在 20 50 ， 对 定结果影响不大；皂化试剂的用量在 2.0 定效果最好 ； 皂化水浴时间控制在 20 30 ，不会对 甲基化试剂用量在 2.5 间时，对 定结果的准确性没有影响。 对 33 种 芽胞杆菌 利用 生物鉴定系统进行鉴定，除去 统数据库中没有的 12 种 芽胞杆菌 ，剩下 21 种 芽胞杆菌 可准确鉴定到种的有 15 株，具体菌株为： 胞杆菌 （ 淀粉 芽胞杆菌 （ 褐 芽胞杆菌 （ 褐 芽胞杆菌 （ 状 芽胞杆菌 （ 形 芽胞杆菌 （ 衣 芽胞杆菌 （ 小 芽胞杆菌 （ 硫胺芽胞杆菌（ 碱 芽胞杆菌 （ 草 芽胞杆菌 （ 结 芽胞杆菌 （ 氏 芽胞杆菌 （ ，其他菌株都可鉴定到 芽胞杆菌属。分析不同条件对 定系统准确性的影响发现，获菌量、培养时间和培养温度对鉴定系统的准确性影响表现为 ： 培养温度 培养时间 获菌量，不同条件内对 定结果也不相同。 33 种 芽胞 杆菌主要 脂肪酸 类型 为： 、 11c、 14:0、 析 不同 获菌量、培养时间和培养温度对每种芽胞杆菌脂肪酸种类和含量的影响发现，对脂 肪酸种类的影响表现为：培养时间 获菌量 培养温度；对脂肪酸含量的影响表现为：培养温度 培养时间 获菌量。 最后，通过本研究总结出 33 种 芽胞杆菌的最适鉴定条件， 33 种芽胞杆 菌可用 25 种方法进行鉴定。 关键词 ：芽胞杆菌； 定系统；脂肪酸；相似性系数 (获菌量；培养时间；培养温度 。 福建农林大学硕士学位论文 2 9 to by of of at of up 09 of by of a of to by of to of At of in of at 050 of at 0of at 2.5 of of at 2.0 33 2 in 5 to be to in 1 4 be of on of to of of on of in of 0, 11c, 0, 15:0 SO 3 of of on of to on of in of on of in of 3 up by 33 be 5 of 福建农林大学硕士学位毕业论文 3 第一章 引言 对 芽胞杆菌 属的研究具有很长的历史，在微生物学研究中占有重要的地位 。早在1835 年， 发现并命名了枯草 芽胞 杆菌 现在的 1864年 引起炭疽病的病原生物命名为 直 到 出 来，其属的分类地位才固定下来。 1872 年，德国植物学家 立了第一个细菌分类系统，根据细菌的形态特征命名了 芽胞 杆菌属 (并将枯草 芽胞 杆菌重命名为 随着芽胞杆菌在 工业、 农业、医药、卫生、环保等方 面的广泛 作用， 它 可 降解土壤中难溶的含磷、含钾化合物， 防治植物病虫害，固定空气中的氮，生产纤维素酶、蛋白酶，生产药用色素 。 因此对 土壤中芽胞杆菌的种类、 含量 、 生物多样性 和 芽胞杆菌分类研究变得尤为重要，近几年对芽胞杆菌 的 研究受 到 国内外学者关注 1,2,3,4， 越来越多的芽胞杆菌新种被发现。 尤其是 20 世纪 70 年代分子分类法和 80 年代的化学分类法的应用， 芽胞杆菌 新 种的鉴定数量增多，分类地位确定的也越来越准确。有的分类系统将 芽胞 杆菌 专门 分为一个属，如 2005 年核准种名目录 (集的 芽胞 杆菌种名有175 个， 2006 年 据库上收集的 芽胞 杆菌种名有 182 个， 2006 年德国菌种保存中心种名目录 (集的 芽胞 杆菌种名有 187个； 有的分类系统将 芽胞 杆菌分为 20多个属，描 述 了 芽胞 杆菌属及其近缘属在内的 芽胞 杆菌共 409 种，其中有 91 个种是同物异名。刘波在出版的 芽胞 杆菌文献研究中列出了 244 种 芽胞 杆菌 5。伯杰氏系统细菌学手册第二版中列述了 芽胞 杆菌 22 个属的 212 种 芽胞 杆菌 。 1、芽胞杆菌的分类 细菌的分类单元主要分为七个基本的分类等级 ( 由上而下依次是：界、门、纲、目、科、属、种。在分类学中，若这些分类单元的等级不足以反映某些分类单元之间的差异时，也可以增加亚等级，即亚界、亚门 亚种，在细菌分类中 还可以在科 (或亚科 )和属之间增加族和亚族等级。 微生物分类学包含微生物的分离 、鉴定、分类、 命名 几 部分。目前细菌分类主要是采用多相分类技术。多相分类 (概念是由 1968 年提出， 现在大多 使用 多相分类法，即将形态 特征 、生理生化 特征 、 分子 (16S 序、 基分析和 交 )特征 、 化学 特征 (脂肪酸 类型、极性脂醌类型等 )等分类方法相结合，根据所得数据进行 多相分类分析 ， 最终 得出相对比较准确 的分类地位 。 1. 1 经典分类 (表型特征 )(表型是由于 环境因素和 基因相互作用引起的，在 微生物 体 上能检测和观察到的特征 ，如菌株的形状，大小，颜色，表面 。一般， 表型特征可将 原核生物 区分到种但不能区分到株 。表型特征包括 微生物的 形态学特征、生理生化特征、 蛋白质 组成特征、 噬菌体分型、血清学 特征 等，在微生物的分类中有重要作用。 福建农林大学硕士学位论文 4 1. 2 分子分类法 (伯杰氏系统细菌学手册 (s 6指出： 1） 同源性 20%以下 的应考虑是不同属的菌种； 2）同源性在 20间认为是同一属中的不同菌种； 3） 源性在 60%以上通常认为是同一种 。 随着 科学 技术的发展， 芽胞 杆菌的分类逐渐由传统的表型分类转化为 更为准确的 分子分类，如 16S 列测序、 交、 G+C 组试验、 术等等。由于 16S 因序列 存在的普遍性和稳定性 ，应用 16S 为分子指标已逐渐成为微生物检测 ，鉴定和 分类的一种强有力 手段 。菌株之间 成的变化是遗传多样化的一个 指标 。 一般 认为同一个分类的 种其 差异 应该不 高于 10 15 G+C 对 芽胞杆菌其变化大约在 33 65%。说明种还可以划分为几个遗传同源性的种类。 7从宇宙飞船设备上 分离到一些微生物 ，经试验证明 分离菌株属于 芽胞 杆菌属， 最终 ， 经过 明分离到的菌为一株 芽胞杆菌新种， 命名为 用 交 和 16S 列系统发育分析 。将 新 确 立为一 个属 将 名为 。 运用 16S 序构建系统发育树 的分析方法 对 最终 将 入 。 利用微生物基因的不同，我们可以运用分子技术将其分类地位划分的更加准确。具体对某种微生物进行鉴定和分类时，一般可采取以下流程进行判定， 即 1. 3 化学分类 (微生物的化学分类学（ 是指 以 微生物的化学组成成分 的差异 为指标进行微生物分类研究的学科。化学分类技术 不是研究微生物的生物学特征而是 是检验微生物的某些化学成分， 组成 微生物 的化学成分，含量或结构与其种属 特征或分类地位密切相关， 他是某一微生物存在的标志， 称为生物标志 ( 这些生物标记 可以作为微生物总 16S 6S 序 用软件建树状图 将所得序列与模式序列比对 找出相似性最高 的序列 与 已知序列进行 对 确定目的菌的分类地位或系统发 育地位 福建农林大学硕士学位毕业论文 5 鉴定 某一种 微生物 属于哪一个种 的标志。 可检测鉴定这些物质的仪器有 气相色谱（ 高效液相色谱（ 液 S)、 气 这些仪器在微生物分类和鉴定中逐渐发挥着越来越大的作用。 从微生物体内分离和提取的脂肪酸经过甲酯化处理后，挥发性大大降低， 适合于气相色谱分析。在 微生物 分类 鉴定 中，气相色谱是分析 微生物 磷脂脂肪酸（ 成分的主要工具。 而 微生物细胞膜组成的主要成分，他的 含量高、化学 成分 相 对 稳定， 且只存在于活细胞中，微生物死亡后，这些物质很快就会降解。 研究 证明 ， 不同微生物体 中存在 大约 三百 多种 其 衍生物。 脂肪酸的种类和含量随着微生物种类的不同而不同。 因此， 可以根据 微生物 脂肪酸 种类和含量 的不同 来鉴定 微生物为什么菌。不同微生物有其不同的特征脂肪酸， 是 微生物 分类的重要指标和依据。目前， 通过对 微生物脂肪酸成分 分析 以成为微生物分类鉴定的新 手段 。 成分分析可以将 微生物 快速 ，准确的 鉴定到种属。宋亚军等人对若 干需氧 芽胞 杆菌的 芽胞 脂肪酸成分进行了系统分析，为需氧 芽胞 杆菌的分类研究提供了新的资料 10。 2、 磷脂脂肪酸的概述 脂肪酸是生物体内的基本 组成 成分之一 ， 绝大多数脂肪酸以结合形式存在于 微生物体 中， 参与生物体的各种代谢活动；同时他与 细胞对物质的识别 、 种 属 特异性等密切相关 11； 因此，脂肪酸 是 一种 非常 有效的生物标记物 12。 现在，脂肪酸作为重要的生物标记已经受到国内外研究者的关注。 磷脂脂肪酸 (析方法是 基于 脂肪酸可作为生物标记物而发展起来的分析技术 。通过分析微生物磷脂脂肪酸 ( 种类和含量 来 确定 微生物的种属 地位 、 同时还可 分析微生物 的物种 多样性 。脂肪酸甲酯图谱分析方法 是一种简便、可靠的分析方法。 脂脂肪酸发展史 术的发展，首先是脂类物质提取技术的发展。早在 20 世纪 60 年代以前， 研究者就在努力 建立检测食品中的脂类物质的方法， 但是， 当时的提取方法存在以下缺点：提取时间长、提取剂消耗大和 提取脂类物质种类少 。 1956 年 第一次提出一个简单、快速地提取鱼类中脂类物质的方法，这 一方法的提出 为磷脂脂肪酸技术 在土壤微生物群 落多样性研究奠定了基础， 现代 提取 土壤 用的试剂 常被叫做 取剂，这种提取剂 是将 氯仿、甲醇和水 按照 1:2:比例混合得到得 。但是， 当时这一方法只用于食品中磷脂的提取并未运用到土壤微生物的研究中。 并且， 该方法只能确定总体脂类含量， 而知道总体脂类含量是不能达到对土壤微生物群落多样性进行分析的。 不能达到对土壤微生物群落结构进行分析的目的。 在 20 世纪 70 年代末和 80 年代初 ， 发展了磷脂脂肪酸分析技术。分析了河口和海底沉积物中磷脂的含量， 最后 认为磷 脂可以作为 一个指标 去推算 微生物生物量的。同时，还可以根据脂类物质的 种类和含量 ，对 土壤 微生物群落结构福建农林大学硕士学位论文 6 多样性 进行分析。 肪酸原理 图分析方法的原理是基于 脂肪酸 几乎是所有 微生物 细胞膜的重要组成部分 ，不同微生物体内具有不同 种类 的磷脂脂肪酸 ， 其 结构和含量 具有种属 特异性 ， 是某一类微生物存在的标志 ， 是一类常见的生物标记物 12,13,14。但是古生菌 的极性脂质是以醚而不是酯键的形式出现 的，故 不能使用 图 对其 进行分析 15。此外 ， 磷脂 只存在于活细胞中，一旦细胞死亡，磷脂马上就会降解， 因此 ， 磷 脂脂肪酸 只 代表微生物群落中存活 的那部分群体 16。 肪酸 分析方法 图分析首先要 进行 取 ， 其次，将提取的 化为稳定不易挥发的脂肪酸甲酯，最后，利用 气相色谱等仪器 进行检测，从 磷脂脂肪酸组成图谱 中可 得到不同脂肪酸的 种类和含量 ， 即所谓的 图。根据 不同脂肪酸的种类和含量 ， 利用相关的数据库和分析软件便可鉴定出样品中微生物的种类或微生物群落结构组成多样性及微生物生物量等信息。对于该研究 ， 主要是 利用 气相色谱 (及气 用色 谱 (17联用实现的。 肪酸种类 (1)脂肪酸分类：首先按碳原子数目不同，可以分为短链（ 2中链（ 6长链（ 12肪酸； (2)按营养角度 可以分为 必需和 非必需两大类。