色谱分析基础

色谱分析法色谱分析法 Chromatography 1. 国国 际纯际纯 粹与粹与 应应 用化学用化学 联联 合会（合会（ IUPAC）的定）的定 义义 Chromatography is a physical method of separation in which the components to be separated are distributed between two phases, one of which is stationary phase while the other moves in a definite direction. 一、色谱法概述 CaCO3 Petroleum ether 茨维特 Experiment 色谱法是一种基于物理作用的分离方法。它的特 点是：物质在两相中分配，一是固定相，一是流 动相，两相作相向运动。 色谱法创始人色谱法创始人 俄国植物学家俄国植物学家 Tswett 色谱的历史色谱的历史 色谱法的发展色谱法的发展 1906年年 Tswett发明色谱的研究方法发明色谱的研究方法 1954年年 Martin色谱塔片理论色谱塔片理论 1958年，年， Giddings毛细管气相色谱毛细管气相色谱 1960年代，高效液相色谱年代，高效液相色谱 1980年代，超临界流体色谱年代，超临界流体色谱 1990年代，大规模制备色谱：生命科学年代，大规模制备色谱：生命科学 2000年代，多维色谱，超高压色谱，快速制年代，多维色谱，超高压色谱，快速制 备：蛋白质组学，药物研发备：蛋白质组学，药物研发 Paper chromatography (PC), 纸色谱法纸色谱法 Thin layer chromatography (TLC), 薄层色谱法薄层色谱法 Ion exchange chromatography (IEC， IC), 离子交换色谱法离子交换色谱法 Gel permeation chromatography (size exclusion, GPC), 凝胶色谱法，体积排阻色谱法凝胶色谱法，体积排阻色谱法 Affinity chromatography (AC)，亲和色谱法，亲和色谱法 Gas chromatography (GC), 气相色谱法气相色谱法 Supercritical fluid chromatography (SFC)，超临界流体色谱法，超临界流体色谱法 High performance liquid chromatography (HPLC), 高效液相色高效液相色 谱法谱法 Capillary (Zone) electrophoresis (CE), 毛细管电泳毛细管电泳 High Speed Countercurrent Chromatography （ HSCCC） 2. 常用的色常用的色 谱谱 分析方法分析方法 术语术语 3. 色色 谱谱 法的分法的分 类类 按流动相的状态分类按流动相的状态分类 气相色谱气相色谱 液相色谱液相色谱 超临界流体色谱超临界流体色谱 按固定相的使用形态分类按固定相的使用形态分类 柱色谱柱色谱 纸色谱纸色谱 薄层色谱薄层色谱 按分离机理分类：按分离机理分类： 吸附、分配、离子交吸附、分配、离子交 换、空间排阻换、空间排阻 色谱新分类法色谱新分类法 按分子间相互作用类型： 一 非特异相互作用色谱 1. 疏水相互作用 2. 离子作用：离子交换，离子排斥（道南效应）和离子对 3. 亲水相互作用 二 特异相互作用 -亲和色谱 1. 免疫亲和 2. 固定化金属亲和 3. 硼亲和 4. 仿生亲和（分子印迹聚合物、适配体、仿生材料） 4. 各种色各种色 谱谱 方法的方法的 应应 用用 （ 1）薄层色谱法）薄层色谱法 设备简单、操作方便设备简单、操作方便 分离速度快（适合多个样分离速度快（适合多个样 品的同时测定）品的同时测定） 样品预处理简单样品预处理简单 对被分离物质的性质没有对被分离物质的性质没有 限制限制 直观、可比直观、可比 HPTLC 用于人参、三七和西洋参的鉴别 最重要的应用领域：药物分析，如中国药典中的最重要的应用领域：药物分析，如中国药典中的 TLC鉴别鉴别 （ 2）气相色谱法）气相色谱法 用于分离分析易汽化、稳定、不易分解、不易反用于分离分析易汽化、稳定、不易分解、不易反 应的样品应的样品 特别适合用于同系物、同分异构体的分离特别适合用于同系物、同分异构体的分离 分离效率高分离效率高 （ 3）高效液相色谱法）高效液相色谱法 用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。用于分离分析高沸点、热不稳定、离子型的样品。 分离效率高于分离效率高于 TLC 分离机理多，应用范围广分离机理多，应用范围广 人参的 HPLC谱图 超临界流体色谱用于齐聚物分析 （ 4） 超临界流体色谱超临界流体色谱 超临界流体：在高于临界压力 与临界温度时，物质的一种状态 。性质介于液体和气体之间。 超临界流体色谱 (SFC)，具有 液相、气相色谱不具有的优点 : （ 1）可处理高沸点、不挥发试 样； （ 2）比 LC有更高的柱效和分离 效率。 （ 5）毛细管电泳）毛细管电泳 毛细管电泳用于 DNA测序 以毛细管为分离通道 以高压电场为驱动力 依据样品中各组分之间电 泳速度和分配行为上的差异 生命科学、药物分析、以 及从小分子、离子到单细胞 分析 电色谱的基本原理和操作 结合毛细管电泳的高柱效和高效液相色 谱的高选择性 色谱柱为填充了 HPLC填料的填充型毛细 管柱和管内壁涂渍了固定相功能分子的 开管毛细管柱 以电渗流为流动相驱动力 分离机理包含有电泳迁移和色谱固定相 的保留机理，溶质与固定相间的相互作 用对分离起主导作用。 CEC与质谱联用既可解决 LC/MS的分离效 率不高的问题，又可克服 CE/MS中质量 流量太小的缺陷。 主要应用在药物、手性化合物和多环芳 烃的分离分析。 电色谱分离酸性化合物 二、色谱理论基础二、色谱理论基础 1. 色谱常用术语色谱常用术语 色谱峰相关色谱峰相关 保留值相关保留值相关 分离效能评价相关分离效能评价相关 peak Peak height Base line Peak width Peak width at half height Peak area Standard error: 色谱流出曲线 （ chromatogram） : 指样品注入色谱柱后，信号随时间变化的曲线。 Retention timeDead time =0.607h 处峰宽的一半 W1/2=2.355 W=4=1.70W1/2 基线基线 :无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。无组分通过色谱柱时，检测器的噪音随时间变化的曲线。 保留时间保留时间 :进样到出现色谱峰的时间进样到出现色谱峰的时间 调整保留时间调整保留时间 死体积：色谱柱的空隙体积死体积：色谱柱的空隙体积 保留体积：进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积保留体积：进样到出现色谱峰时消耗的流动相体积 调整保留体积：扣除死体积后的保留体积调整保留体积：扣除死体积后的保留体积 相对保留值：在相同的操作条件下，组分与参比组相对保留值：在相同的操作条件下，组分与参比组 分的调整保留值之比分的调整保留值之比 分配系数分配系数 K（ distribution coefficient ）：）： 一定温度与压力 下两相达平衡后，组分在固定相 和流动相浓度的比值 容量因子 k （ retention factor， capacity factor)：一定温度与压力 下两相达平衡后，组分在固定相 和流动相量的比值 相比相比 （ phase ratio）：色谱柱）：色谱柱 中流动相与固定相相体积之比中流动相与固定相相体积之比 理论塔板数（柱效）理论塔板数（柱效） n （ Number of theoretical plates ） K=CS/CM k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0) /t0 选择性因子选择性因子 Separation factor ）：）： 相邻两组分的分配系数或相邻两组分的分配系数或 容量容量 因子 之比之比 分离度分离度 R （ Resolution factor） ：相：相 邻邻 色色 谱谱 峰保留峰保留 时间时间 之差之差 的两倍与两色的两倍与两色 谱谱 峰峰基峰峰基 宽宽 之和之和 的比的比 值值 R 1.0 两峰明显重叠 R = 1.0 两峰达 97.7% 分离 R 1.5 两峰完全分开 R= 0.59R 与化合物在固定相和流动相中的分配 性质、柱温有关，与柱尺寸、流速、 填充情况无关。从本质上来说， 的大 小表示两组分在两相间的平衡分配热 力学性质的差异，即分子间相互作用 力的差异。 2色谱理论基础色谱理论基础 色谱热力学理论色谱热力学理论 试样在两相间分配试样在两相间分配 色谱动力学理论色谱动力学理论 组分在色谱柱中运动，峰宽与传质关系组分在色谱柱中运动，峰宽与传质关系 塔板理论塔板理论 速率理论速率理论 色谱热力学理论色谱热力学理论 分子间作用力：色散力、诱导力、取向力、分子间作用力：色散力、诱导力、取向力、 氢键氢键 气相色谱：溶质与固定相间气相色谱：溶质与固定相间 液相色谱：溶质与固定相、流动相间液相色谱：溶质与固定相、流动相间 重要热力学参数重要热力学参数 分配系数分配系数 K 容量因子容量因子 k 保留值热力学方程保留值热力学方程 GC：温度；：温度； HPLC: 洗脱强度洗脱强度 K=CS/CM 分配系数 K与柱中固定相和 流动相的体积 无关，而取 决于组分及两相的性质， 并随 柱温、柱压变化而变 化。容量因子 k决定于组分 及固定相的热力学性 质， 随柱温、柱压的变化而变 化，还与流 动相及固定相 的体积有关。 k=mS/mM=KVS/VM=(tR-t0) /t0 （ 1）塔板理论 目的 从理论上得到描述色谱流出曲线 的方程，并通过这一方程各参数来研究影 响分离的因素。 假设 （ 1） 色谱柱存在多级塔板 ; （ 2）组分通过时在每级塔板两相间达 到一次平衡 ; 色谱动力学理论色谱动力学理论 r 塔板数 N 转移次数 设：有 A、 B两组分， kA = 2 kB = 1/2 当 N = 0 r = 0 A组分在两相分配达平衡后： 流动相分量 = 固定相分量 = r0 r1 r2 。 。 。 。 。 。 。 。 rn 下表列出经过各级转移后组分在每一级塔板中的量： 色谱流出曲线方程 c:流动相流过体积 v时柱出口组分浓度； m为进样量； b为与 塔板高度、柱长、容量因子等有关的参数 V=VR时 ， m cmax 由于所获得的流出曲线在 N很大时呈正态分布 ，因此可将流出曲线方程转化为正态分布方程形式： 将此方程与标准正态分布曲线方程比较： 可知： 所以： 或： 根据： 所以： n 称为色谱柱的理论塔板数。 因为 tR是热力学常数，当色谱柱的长度一定， 理论板数目 n越大，色谱峰越窄。 （ 2）速率理论）速率理论 概述概述 速率理论是速率理论是 1956年荷兰学者年荷兰学者 Van Deemter等提出，等提出， 因此又称作范第姆特方程。因此又称作范第姆特方程。 运用运用 流体分子规律流体分子规律 研究色谱过程中产生研究色谱过程中产生 色谱峰扩展色谱峰扩展 的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关的因素，导出了理论塔板高度与流动相线速度的关 系，揭示了影响塔板高度的动力学因素。系，揭示了影响塔板高度的动力学因素。 n 气相色谱气相色谱 中中 速率方程的导出速率方程的导出 根据塔板计算公式：根据塔板计算公式： n=5.54(tR/W1/2)2 速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影速率理论讨论的是色谱峰展宽原因，即影 响塔板数响塔板数 n的因素，也就是影响塔板高度的因素，也就是影响塔板高度 H 的因素。的因素。 H=A+B/u+Cu 涡流扩散项涡流扩散项 A=2dp 涡流扩 散项 均匀性 因子 粒径 涡流扩散项涡流扩散项 A 由不等路径造成的色谱峰扩展由不等路径造成的色谱峰扩展 。由于柱填料粒径。由于柱填料粒径 大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成大小不同，粒度分布范围不一致及填充的不均匀，形成 宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成宽窄、长短不同的路径，因此流动相沿柱内各路径形成 紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行紊乱的涡流运动，有些溶质分子沿较窄且直的路径运行 ，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有，以较快的速度通过色谱柱，发生分子超前，反之，有 些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。些分子发生滞后，从而使色谱峰产生扩散。 分子扩散项分子扩散项 B/u项项 其中其中 B=2Dg 弯曲 因子 扩散 系数 分子扩散项分子扩散项 由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。由于分子的纵向扩散造成的色谱峰扩展。 即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞即由于试样组分被载气带入色谱柱后，是以塞 子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由子的形式存在于色谱柱的很小一段空间中，由 于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的于在塞子前后存在浓度梯度，因此使运动着的 分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。分子产生纵向扩散，引起色谱峰扩展。 传质阻力项传质阻力项 由气相传质阻力和液相传质阻力两项组成 气相传质阻力项气相传质阻力项 Cgu 试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由试样组分从气相移动到固定相表面的过程中，由 于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使分 子有滞留倾向。子有滞留倾向。 在此过程中，部分组分分子随流动相在此过程中，部分组分分子随流动相 向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。向前运动，发生分子超前，引起色谱峰扩展。 容量因子 液相传质阻力项液相传质阻力项 CL u 试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中试样组分从固定相表面移动到固定相内部的过程中 ，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使，由于质量交换过程需要一定时间（即传质阻力）而使 分子有滞留倾向。分子有滞留倾向。 在此过程中，部分组分分子先离开固在此过程中，部分组分分子先离开固 定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。定相表面，发生分子超前，引起色谱峰扩展。 液相扩 散系数 液膜厚度 n 速率方程给我们的什么启示速率方程给我们的什么启示 ？ 为柱型的研究和发展提供理论依据为柱型的研究和发展提供理论依据 为操作条件的选择提供理论指导为操作条件的选择提供理论指导 为色谱柱的填充提供理论指导为色谱柱的填充提供理论指导 对柱型研究和发展的影响（对柱型研究和发展的影响（ 1） A=0? Golay1957年提出年提出 毛细管柱毛细管柱 的概念的概念 （ opentube ） 毛细管柱毛细管柱 A=0， H=B/u+Cu H， N， 分离能力大大提高分离能力大大提高 液体作流动相时可用更细的固定相，液体作流动相时可用更细的固定相， A 对柱型研究和发展的影响（对柱型研究和发展的影响（ 2） B=0? 溶质在液体中的扩散系数溶质在液体中的扩散系数 DL10-5cm2/s 溶质在气体中的扩散系数溶质在气体中的扩散系数 Dg10-1cm2/s DL Dg 当采用液体作流动相时当采用液体作流动相时 B 0 载气线速度（流速）的影响载气线速度（流速）的影响 最佳流速：最佳流速： u=(B/C)1/2 实用最佳流速实用最佳流速 ：比最佳流速更快：比最佳流速更快 A与流速无关与流速无关 B/u：当流速小时，对：当流速小时，对 H的大小起主导作用的大小起主导作用 Cu：当流速大时，对：当流速大时，对 H的大小起主导作用的大小起主导作用 操作条件对柱效的影响（操作