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变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用 【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用 【中图分类号】R9192 【文献标识码】B 【文章编号】10079297(XX)02006304 随着人类基因组计划的实施和迅速发展人类基 因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多 样性均与基因的突变有关。因此，对基因突变的筛选 或诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意 义。近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷 的同时，经典的方法也不断得到改进。其中。由 Fischer 和 Lerman ，2】创立的变性梯度凝胶电泳 (denaturing gra dient gel electrophoresis，DGGE)历经多次改良， 已发 展成一类极具实用价值的常规突变检测技术被广泛 应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态 性分析、微生物种群研究等各个领域。 一 、DGGE 基本原理 DGGE 是利用 DNA的物理性质进行突变分析的。 其原理是基于待测 DNA 片段双螺旋的解链温度 (melting temperature。Tm)。Tm 值由 DNA片段的碱基 数目和碱基组成共同决定。主要引起低温解链区域解 链。当 DNA片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线 性梯度增加的凝胶中电泳时。起初双螺旋 DNA片段 以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性 效果相当于其 Tm值的变性剂浓度点时双链 DNA开 始部分解链部分解链后的 DNA分子呈分枝状使其 迁移速度极度减缓几乎处于“停顿”状态。长度相 同 但序列不同的 DNA片段。即使仅存在单个碱基改变。 也将影响邻近碱基间的相互作用导致 Tm值的改变 从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”这样 DNA 片段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。 上述原理仅能检测 DNA片段中低温解链区存在 的序列差异或突变而位于高温解链区的则无法检 出因高温解链区解链的变性条件可使整个双链完全 解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。基于此可 通过克隆或 PCR方法在待检目的片段的 5 端引入 3O 5O 个 GC碱基组成的寡核苷酸链 即 GCClamp。 使其成为片段中 Tm最高的区域，从而使目的片段高 温解链区解链时 DNA双螺旋不至于完全解链成单 链，极大增加 DGGE的突变检出率。3 变性梯度凝胶是有方向性的，据此可将 DGGE分 为两类：垂直 DGGE和平行 DGGE。垂直 DGGE的变 性剂梯度方向与电泳方向垂直，可用于确定同一 DNA 片段上不同的解链区域、优化样本的分离条件或分析 PCR 产物的组成；平行 DGGE的变性剂梯度方向与电 泳方向一致，在所检测的 DNA解链区域和温度已知 的情况下可用于多个样本的同时分析。 二、DGGE 衍生技术 圈 I t 曩 (一)恒定变性凝胶电泳(constant denaturant gel electrophoresis，CDGE) 由 Hovig等嗍(1991 年)在 DGGE的基础上发展 而来它是通过预试验或理论计算预先精确确定待测 DNA 片段的 Tm值后即采用相当于该 Tm值的单一变 性剂浓度的凝胶电泳使不同的 DNA片段各自以不 同但恒定的速度迁移。CDGE 避免了化学变性剂梯度 的应用且选择特定的最佳变性剂浓度可获得最好的 分辨效果。同时克服了 DGGE电泳时间长的缺点，使 其变得更加简单快速。但对含有多个解链区域的目的 片段需选择不同浓度的变性凝胶以提高检测效率。因 需事先精确确定待测片段的 Tm值。故该法主要用于 已知突变的检测。 【基金项目 l 国家自然科学基金资助(No30300399) 【作者简介 l 黄代新(1969 一)，男，湖北松滋人，博 士，副教授，主要从事法医分子遗传学研究。 146 (二)温度梯度凝胶电泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE) TGGE 凝胶中含有固定浓度的化学变性剂，在电 泳过程中通过微处理器控制从凝胶的顶端到底端形 成一线性增加的温度梯度，以此取代 DGGE中的化学 变性剂浓度梯度。变性环境由凝胶中恒定浓度的变性 剂和温度梯度共同构成。5,61 由于无需制备变性梯度 胶，TGGE 较 DGGE更加简单稳定。但目前大多 TGGE 仪器所允许的温度范围为 1580 ，较大片段的 Tm 值会因接近 8O从而增加了检测的困难。 (三)瞬时温度梯度凝胶电泳(temporal tempera ture gradient gel electrophoresis，TTGE) 由日本学者 Yoshino等同于 1991年建立最初称为温 度掠扫凝胶电泳(temperature sweep gel electrophoresis， TSGE)，后改称为 TYGE。其原理类似于 TGGE，是在加 有一定浓度化学变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程 中，使凝胶板的温度以恒定速度逐渐升高，从而在跑 胶的过程中形成一个温度梯度，这样整个凝胶中任何 位置的温度在任何特定的时间点都是相同的，但随着 时间的改变而变化。凝胶的温度条件可用相关软件 (如 MacMelt、WinMelt 软件等)从相应序列的理论解链 曲线获得，而无需通过大量实验摸索。FGE 无需制备 变性梯度凝胶，随时间而调整温度也较 TGGE更易操 作同时在不降低灵敏度的前提下其分离范围更宽， 可检测长达 lkb的片段。尤其是通过调节温度范围 (窄或宽)及升温速度可以很灵活地调节 TYGE的分离 范围81。 三、DGGE 的主要技术特点 作为常规突变检测技术DGGE 具有以下优点：(1) 高检测率和灵敏度。对几百 bp长的 DNA片段，使用 带 GCclamp的 PCRDGGE技术 突变检出率接近 100。在 TGGE中，一般 2ram可对应 06温差，而 在 TIGE 中每小时升温可控制为 01 极小的 Tm 值差 异也可被检出，尤其适用于单碱基突变个体的筛查。 在含量方面，DGGE 的检测灵敏度可达 1。(2)检测片 段长，可达 1 kb。但其最适分离范围为 100500 bp，随 着片段长度增加其检出率相应降低。(3)简单快速。 主 要电泳条件均由微处理器控制。如用 BioRad公司的 DCODE 突变检测系统最快可在 2小时内检测 64个 样品。(4)可从凝胶中分离回收片段直接用于测序。当 然该技术也存在一些不足之处：(1)实验之初需进行 计算机分析或预试验以确定最佳的分离条件。(2)使用 带 GCclamp的引物增加了实验费用。(3)GC 含量较高 的片段用 DGGE不易分析。(4)制备精确的梯度凝胶需 法律与医学杂志 XX年第 12卷(第 2期) 要熟练的操作技巧及复杂的仪器设备。(5)仅能检测突 变的存在但不能确定突变类型，需进一步测序确定。 四、法医学应用 (一)在法医 DNA 分型中的应用 DGGE 及相关衍生技术高效率的突变检测能力使 其在法医 DNA多态性分型中具有极大的应用潜能。 1991 年。Burmeister 等91 采用类似 RFLP的基因组 DGGE(genomic DGGE，gDGGE)技术分析人类 21号 染色体长臂近侧区的序列多态性取得良好的效果。与 RFLP 不同的是， 即使限制性内切酶消化后片段长度 相同的消化产物 gDGGE也能分离。在蛋白遗传标记 的基因分型方面，1991 年，Johnson 等【 Ol用 DGGE 技术 成功检测出人类 f一 1一抗胰蛋白酶基因的所有主要 等位 基因(M1Ala、M1Val、M2、M3、S 和 Z)以及存在于内含 子 3和 4中的大量遗传多态性。次年，Johnson 等 【l】1 又 用 PCRDGGE技术尝试对 ABO血型进行基因分型 一次扩增即可成功检测 6种主要基因型，同时还发现 了未曾报道过的 O和 B等位基因中包含的序列多态 性，在 95个无关欧洲个体中共检出 4个不同的 O等 位基因和 2个不同的 B等位基因，从而使该系统的法 医学应用价值大为提高。Takahashi 等【 21(1991年) 在 分析日本人群人类 f-球蛋白基因 5 侧翼区 A 兀rr 串 联重复多态性时以 RNA ：DNA 形成异源双链方式 采用 DGGE技术，除成功检出已报道的重复次数为 5 和 6的两个等位基因外还检出了重复次数为 7和第 5 个重复单位中形成 AG 替换的 2个新等位基因。 Chen 等【 31(1994 年)用 TGGE技术对 HLADRB3第 二外显子 271bp的扩增片段采用 35 7O 的温度 梯度进行分析 在 HLADRB3的 4个等位基因 DRB3*0101、“0201、*0202 和“0301 中可成功检出 3 个同源双链片段其中“0201 和*0202 因具有相同的 热稳定性无法区分，但可通过人工形成异源双链的方 法加以区分证实了 TGGE技术是检测 HLA基因型 的有效手段。Steers 等【 (1996年)用 PCRDGGE技 术 通过扩增分析 RHD和 RHCE基因的第 2、第 5外显子 成功地从基因组 DNA实现了 Rh表型分型。日本学者 MatsuzakiTakada 和 Mukaidat 5】通过精心设计引 物和 优化实验条件采用 PCRDGGE技术实现了在同一 凝胶板上同时进行红细胞血型 MN、Dufy 和 Kidd以 及血清型 Gc的基因型分型。 mtDNA 多态性多表现为不同核苷酸的替换，故 PCRDGGE 这种灵敏高效的突变筛选技术非常适于 mtDNA 的突变筛选或检测对此已有较多的研究报道 R 7J 。利用 DGGE技术进行 mtDNA分析不仅可以同时 法律与医学杂志 XX年第 l2卷(第 2期) 进行多个样本的检测比对而且还可应用于 mtDNA 异质性分析。1999 年，Steighner 等181 在评估 PCR DGGE 技术检测 mtDNA高变区 l(HV1)序列多态性 的可靠性时，所有设计的 49对配对序列(每对仅存在 1 个碱基差异)用该技术可全部有效加以区分。次年 该研究小组又用 DGGE技术对 253个随机个体的 mtDNA HV1 进行了分析，发现 35个个体存在异质 性，其中 33个为单核苷酸异质，2 个为二核苷酸异质， 进一步证实了 mtDNA异质性存在的普遍性，而且该 技术检测异质性的灵敏度高达 1o19。 (二)在法医病理学研究中的应用 法医病理学中 DGGE技术的应用相对较少。1999 年，Opdal 等 用 PCRTIGE技术对 158例婴幼儿猝 死综合征(SIDS)和 97例正常对照的 mtDNA 3230 3330nt 区域进行分析从 4例 SIDS中检出 3个不同的 点突变(T3290C、T3308C 和 T3308G)而对照组未检 出同时发现这 4例 SIDS的 mtDNA D一环区碱基替换 率较高，提示 mtDNA的突变在部分 SIDS中起作用。 NObel 等 用 PCRDGGE技术对蓝藻和硅藻群 落的 16S rDNA进行研究，发现不同时间、不同环境的 水体或土壤，其蓝藻和硅藻群体的电泳图谱构成均不 相同，形成高度特异的“群落指纹”。基于此，作者 设计 课题将该技术引入法医学用于溺死的诊断研究，以期 建立一种特异性好、灵敏度高，既能定性诊断溺死， 同 时又能提示溺死地点的全新的分子生物学鉴定方法， 且初步的研究结果较为理想。 五、展望 随着相关技术的发展，DGGE 技术也会不断发展， 其突变检测能力将进一步增强。如 Gelfi等 将 TGGE 与毛细管电泳结合建立了高度灵敏的温度梯度毛细 管电泳(temperature gradient capillary electrophoresis， TGCE)技术并成功分析了囊性纤维化跨膜传导调节 蛋白(CYFR) 基因外显子 17b 中的 3个点突变 (R1066H、R1066C 和 F1052V)和外显子 14a中的两个 多态性(V868V 和 T854T)。此外，将荧光技术与 DGGE 结合的荧光多重复合 DGGE (Fluorescent Multiplexing of Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，FMDGGE) 技术 (http：wwwmiraibiocompdftechappnotes Mutation 20Detection20pdf)可使具有多个解链区的多 个位点在同一凝胶上通过重复扫描进行分析，实现了 相对高通量、快速、灵敏的检测目标。相信随着其检 测 能力的不断提高，DGGE 技术定会在更多的领域发挥 更加重要的作用。 参考文献 l47 【l】Fischer SG，Lerman LSLengthindependent separation of DNA re striction fragments in twodimensional gel electrophoresis啪 Cell， 1979，16(1)：191-200 【2】Fischer SG，Lerman LSDNA fragments difering by single base-pair substitutions are separated in denaturing gradient gels： correspon dence with melting theory咖Proc Natl Acad Sci USA，1983，8O(6)： 1579-1583 【3】Shefield VC，Cox DR，Lerman LS，et a1Attachment of a 4|D-base pair G+Crich sequence fGC-clamp)to genoc DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of singlebase changesJProc Nail Acad Sci USA，1989，86(1)： 232-236 4】Hovig E，Smith-Sorensen B，Brogger A，et a1Constant denaturant gel electrophoresis，a modification of dena 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