17β-雌二醇对胃粘膜细胞系ges-1中er-α蛋白表达的影响

17-雌二醇对胃粘膜细胞系GES-1 中ER-蛋白表达的影响 张尚昆 （江汉大学医学院病理学与病理生理学教研室 湖北 武汉 430056） 摘要：观察不同浓度雌二醇处理不同时间的情况下，人正常胃粘膜细胞系GES- 1中ER-蛋白表达量的变化，探讨正常胃粘膜细胞中雌激素对ER- 蛋白表达可能存在的影响方法：GES-1细胞经510 -6mol/L、510 -8mol/L、10 - 12mol/L和10 -14mol/L的17- 雌二醇(17-estradiol ，E2)处理24h，应用Western Blot及灰度分析的方法检测蛋白表达量的改变，平均光密度值采用t检验分析。 关键词：雌激素；ER- ；正常胃黏膜细胞系 胃癌是中国常见恶性肿瘤之一 1 ，其男女发病率为2：1。Sipponen 等发现 女性胃癌发生时间较男性推迟10- 15年，绝经期后发病率与男性相近 2 。经典的雌激素受体（estrogen receptor，ER-，又称ER- 66）在胃癌中表达率远较乳腺癌低（2%28%），长期以来胃癌被认为是非 雌激素依赖性肿瘤。近期研究发现，选择性雌激素受体调节剂他莫昔芬（Tamo xifen， TAM）与胃癌的发生有关 2 ，雌激素在多种传统意义上的非雌激素依 赖肿瘤中发挥重要作用 2 ，但是，雌激素对正常胃细胞系是否也有影响的研 究尚不清楚。 ER-36是2005 年发现的独立存在的ER- 66的同源异构体。其在乳腺癌中被证明与乳腺癌细胞的生长相关，尤其是在E R-阴性的乳腺癌中发挥重要作用，并已经发现ER-36对ER-66和ER- 具有抑制作用 2 。ER- 36在胃癌中的表达情况和生物学作用未见报道。来自我们的前期研究发现，人 胃癌组织中存在ER- 36分子表达（mRNA和蛋白质），并且癌组织中表达量高于癌旁组织及正常组 织，胃癌组织及胃癌细胞株中ER-36的表达高于ER-66，胃癌ER- 36mRNA表达与胃癌淋巴结转移相关 3 。 1 胃癌 近年来研究发现，胃癌与雌激素以及雌激素受体有关。在胃癌组织中检测 出了雌激素受体的存在。王陆佰等 8 采用实时荧光定量 RT-PCR 方法检测了4 株胃癌细胞 AGS、BGC-823 、MKN-45、SGC-7901中ER-36和 ER- 66mRNA的表达情况；采用半定量 RT-PCR方法检测 20例人胃腺癌组织中肿块、癌旁组织及正常组织中的 ER-36和 ER-66mRNA 表达情况。结果显示：ER-36和 ER-66的mRNA 在胃癌细胞株和人体胃癌样本中均有表达。胃癌细胞株中ER- 36表达量高于ER-66 ；人体样本中 ER-66在正常组织表达量最高，ER- 36在癌组织中表达量最高，且与患者的年龄、肿瘤的大小、组织学分级以及淋 巴结转移相关。研究结果显示：ER-36在胃癌细胞中发挥的作用可能大于ER- 66，ER-36mRNA 的高表达与胃癌的生物学行为相关。 2 雌激素受体 ER-的生物学效应 初步研究的结果发现，ER- 36具有细胞因子的作用，在细胞的生长与凋亡中发挥重要作用。传统的雌激素 受体ER- 66为核受体，主要分布在细胞核中，属于核受体超家族成员，由配体激活存在 于核内的转录因子，行使其生物学效应。通过成骨细胞膜实验验证，与经典的 雌激素受体ER-66 不同， ER- 36为膜受体 9 ，大量分布于细胞膜的表面，接收来自细胞外和细胞内的信号 转导。作为膜受体的ER-36在生理、病理过程中发挥了与经典 ER- 66不同的生物学效应。一般情况下，它可以介导细胞信号传导通路，在细胞的 内外信息交流中发挥重要作用。研究显示，ER- 36既可以被雌激素激活，又可以被抗雌激素激活，通过Caveolin-1 介导的 MAPK 信号通路的激活促进乳腺癌细胞增殖 10 。Caveolin-1 单倍不足可以促进正常乳腺细胞的早期转化 11 ，其机制与 ER-36介导的 PI3 K/AKT 信号通路的激活有关 11 ；雌激素受体 ER- 36参与了子宫内膜癌中睾酮诱导的细胞增殖信号通路的调节 12 。此外，雌激 素受体ER- 36在肝癌和胃癌信号通路调节中亦发挥着重要的生理学作用。由于这种新型的 雌激素受体在机体中各个器官的分布以及调节作用与传统的雌激素受体 ER- 66具有一定的差异性，因此，值得我们更进一步地研究和探讨。 3 ER-在胃癌细胞中的表达 雌激素(estrogen ，E)是一种由内分泌系统产生的类固醇性激素，雌激素与 其靶器官乳腺等组织的肿瘤发生密切相关 3 。雌激素通过与雌激素受体(estrog en receptor，ER)的结合，传递细胞生长的信号，对靶器官组织的肿瘤形成产生影 响。近年来的研究发现，雌激素及雌激素介导的信号转导通路在非雌激素依赖 的肿瘤如肺癌、膀胱癌及大肠癌等的发生中具有非常重要的作用 4 。胃癌中 雌激素及雌激素受体作用机制的研究，虽起步较早但一直未取得突破性进展。 雌激素及雌激素受体在胃癌发生与发展、侵袭与转移中是否存在并发挥何 种作用，相关研究仍无定论。早期的研究认为，ER 表达水平与胃癌病人的肿瘤大小、性别、年龄无明显关系 5 。目前研究多认 为，ER 阳性的胃癌多为低分化，伴有淋巴结转移及浆膜侵犯，生物学行为不良，预后 不佳 6 。国内赵新汉等应用原位杂交技术发现ER 3 mRNA较ER 蛋白有更高的阳性表达，且多集中于管状腺癌、低分化腺癌、印戒 细胞癌，ER mRNA的表达与胃癌生物学特征密切相关。Takanoa 5 等发现，胃癌组织中ER -mRNA阳性表达率为51%，ER- mRNA阳性表达率为73%；而在正常胃组织，ER- mRNA阳性表达率为37%，ER- mRNA阳性表达率为88%，且二者的表达变化和胃癌的转移密切相关。 ER-66是最早发现的雌激素受体- 亚型(即传统观念的ER- )，已有研究发现在那些对雌激素敏感的细胞的增殖过程中，ER- 66可以起到活化促进生长基因表达的重要作用 6 。ER- 36是王兆一等在2005年克隆并发现的雌激素受体 - 的新亚型，分子质量为35.7kU，经过基因序列的测定、克隆技术和蛋白质技术 的证实后，将该蛋白质命名为ER-36 6 。与ER-66相比，ER-36 7 缺少AF- 1和AF- 2两个转录功能激活域，其主要定位于细胞膜，通过膜雌激素受体介导快速信号 转导通路，产生各种生物学效应，并与肿瘤细胞的分化、增殖及凋亡等有密切 关系。 4 雌激素的生长调节作用 当前仍存在争议。Harrison等报道，雌激素不能调节胃癌细胞系的生长，而 近期观点认为，雌激素能促进胃癌生长 13 。本项研究发现E 2可促进胃癌细胞 生长，在10 -10，10 -11和10 - 12mol/L时，随着E 2浓度的降低生长速度加快。该现象与绝经前期女性（生理状 态下高雌激素水平）胃癌发病率较男性胃癌低，绝经期后这种差异消失的临床 特点具有一致性 2 。本研究首先使用无酚红培养基处理细胞以去除细胞培养 过程中酚红的类雌激素作用，然后，使用1%的活性炭处理的胎牛血清进行胃癌 细胞培养，以降低其他生长激素对细胞生长的影响，在此基础之上，给予不同 浓度的E 2处理细胞可以准确的反映雌激素对细胞生长的作用效果。结果发现， 雌激素确有促进细胞生长的效应，且与雌激素的浓度有关。据此推测，E 2可促 进胃癌细胞生长。 ER-36是2005 年发现的ER-的同源异构体 2 。其蛋白分子质量为36 kU，基因结构特征为：缺少转录激活域AF1和部分 AF2，但保留有DNA结合域 、部分二聚化域和部分配体结合域，启动子与ER- 66完全不同，并具有17个氨基酸长度的特征性序列。ER- 36在胃癌细胞中的表达及生物学作用尚无文献报告 14 。本项研究在不同E 2 处理条件下，观察了ER- 36基因和蛋白质水平的表达变化。在mRNA水平，给予不同浓度的E 2处理，E R-36的表达量均较未处理组增高，并有浓度依赖效应。而在蛋白质水平，ER- 36的表达变化与mRNA水平并非有完全一致的关系。表现为ER- 36蛋白的表达量与E 2浓度呈现依赖效应，但在24h 时，ER- 36蛋白的表达量高于未处理组，而48h时则均低于未处理组。其结果显示，给 予雌激素作用后，胃癌细胞的ER-36 mRNA水平呈现持续的增加（24h 和48h），而ER- 36蛋白质的表达量则出现先上升（24h）后下降（48h）的变化趋势。据此我们 推测，雌激素可能通过调控位于细胞膜上的ER- 36分子，介导了细胞内的效应，E 2-ER- 36途径在胃癌生长调控中可能发挥重要作用。 基于ER- 36在乳腺癌和结直肠癌中的生物学作用和相关作用机制的研究，我们前期的工 作发现，并结合上述的实验结果提示，ER- 36分子可能在雌激素介导的胃癌细胞生长中发挥比 ER- 66更为重要的作用 15 。首先，在无雌激素培养背景和雌激素处理的情况下， E2处理 24h时， ER- 36在mRNA和蛋白表达水平上随着雌激素浓度的升高而增高，说明E 2对胃癌 细胞的促生长作用是通过ER-36实现的，且胃癌细胞中存在转录水平对ER- 36分子的调控 2 ；其次，在E 2处理48h时，虽然 ER- 36在mRNA和蛋白质水平表达量仍与E 2浓度变化一致，但蛋白表达量却明显 降低，说明随着雌激素作用时间延长，胃癌细胞可能在翻译水平对ER- 36存在调控，其具体机制有待进一步证实 16 。 5 结束语 本项研究通过使用不同浓度的17B一雌二醇(17B estradiol，E2) 对人正常胃粘膜细胞株GES-1进行处理，观察胃黏膜细胞ER- 蛋白水平的变化，探讨雌激素对胃正常细胞可能存在的调控作用。 5 参考文献 1 吴春晓，郑莹，鲍萍萍，等上海市胃癌发病流行现况与时间趋势分析J 外科理论与实践，2008，13：24-29 2 邓昊，镇鸿燕，范军，周迪炜，陈莹，刘丽江 . 17- 雌二醇可促进胃癌细胞BGC823生长J.武汉大学学报，2012.33：150- 157. 3 王陆佰，邓昊，黄萱，等胃癌中雌激素受体 - 36与66mRNA的表达及其临床病理意义J武汉大学学报，医学版， 2010，31：38-42 4 Shen SS， Smith CL，Hsieh J T，et al.Expression of est rogen receptors -alpha and -beta in bladder cancer cell lines and human bladder tumor tissueJ.American Cancer Society，2006，106：2610-2 616. 5 Takanoa N，Iizuka N， Hazama S，et al.Expression of est rogen receptor-alpha and -beta mRNAs in human gast ric ancerJ. 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