2012cb518500 经穴效应循经特异性规律及关键影响因素基础研究

项目名称： 经穴效应循经特异性规律及关键影响因 素基础研究 首席科学家： 梁繁荣 成都中医药大学 起止年限： 2012.1-2016.8 依托部门： 国家中医药管理局 四川省科技厅 一、关键科学问题及研究内容 （一）项目研究工作假说 循经性是经穴效应特异性的基本表现形式，针刺手法、穴位配伍和得气是影 响经穴效应循经特异性的关键因素，局部始动- 中枢整合 -效应器官响应多环节靶 向调节是经穴效应循经特异性的生物学基础。 （二）拟解决的关键科学问题 在前期已完成 973 计划项目初步证实经穴效应存在特异性的基础上，运用多 学科研究方法与手段，基于临床， 深入阐明经穴效应 循经特异性基本规律和关键 影响因素，揭示经穴效应循 经特异性多环节靶向调节的生物学基础。 （三）主要研究内容 1、经 穴效应循经特异性基本规律的临床评价研究 以中医针灸理论为指导，结合针灸临床研究规范、 临床流行病学、循 证医学 和 GCP 临床研究原则，以慢性稳定性心绞痛、原发 性高血压等针灸有效病证为研 究载体，运用多中心 RCT 的研究方法，通 过客观、科学的临床评价手段，进一步 证实经穴效应循经特异性基本规律。 2、经 穴效应循经特异性基本规律的生物学基础研究 （1）经穴效应循经特异性局部启 动靶向调节生物学基 础研究 运用在体组织膜片钳、微透析、基因敲除、质子激发 X 射线荧光发射（PIXE） 等技术和手段，重点向神经纤维- 肥大细胞关联，肥大 细胞脱颗粒下游分子事件、 肥大细胞- 微循环关联等在局部始动环节的靶向调节机制深入，揭示经穴效应循 经特异性基本规律的局部启动机制，阐释经穴效应循经特异性基本规律在局部 始动环节的生物学基础。 （2）经穴效应循经特异性中枢靶向整合生物学基 础 研究 运用功能磁共振/事件相关电位（fMRI/ERP）等功能神经影像技术和复杂网络 分析技术， 观察比较循经、非循经、非经非穴针刺对脑 功能活动的影响，深入揭 示经穴效应循经特异性的中枢整合响应模式特征。 （3）经穴效应循经特异性靶器官响 应生物学基础研究 运用双源 CT 双能量心肌灌注成像技术，重点针对靶器官血流响应模式特征， 揭示经穴效应循经特异性靶器官血流动力学响应模式及特征；采用酸敏感离子通 道（ASIC2-/-，ASIC3-/-）基因敲除小鼠，针对靶器官细胞膜钾、钠、钙离子通道及相 关蛋白，揭示经穴效应循经 特异性靶器官离子通道响应模式及特征；采用条件基 因敲除等技术结合，重点针对 靶器官肾上腺素 -受体、毒蕈碱 M2 受体及其信号 转导通路，揭示经穴效应循 经特异性靶器官受体响应模式及特征；采用代谢组学、 ChIP-seq 技术结合，揭示经穴效应循经特异性靶器官分子响应模式及特征。 通过局部始动、中枢整合、靶器官响应三个环节的研究，系统、全面、深入地 揭示经穴效应循经特异性基本规律的生物学基础，阐释经穴效应循经特异性基 本规律的科学内涵。 3、经 穴效应循经特异性的关键影响因素的基础研究 （1）针刺手法对经穴效应循 经特异性的影响特点及分子机制 采用多因素设计方法，明确不同捻转手法参数对经穴效应特异性的影响特 点，为针 灸临床提供新的针 刺手法运用依据；围绕针刺手法的力学事件，结合局 部生物力学、生物化学、分子生物学、蛋白组学等技术手段探讨不同捻转手法对 自发性高血压大鼠（SHR） 肾素-血管紧张素-醛固酮系 统（RAAS）的相关分子及差异 蛋白质的影响，揭示针刺手法影响经穴效应循经特异性的分子机制。 （2）穴位配伍对经穴效应循 经特异性的影响特点及中枢整合机制 采用随机、对照临床研究方法，观察不同配伍方案针刺降压效应差异，探 讨 穴位配伍对经穴效应特异性的影响特点。运用 fMRI/PET-CT 多模态神经影像技术 和复杂网络分析技术，揭示不同穴位配伍方法影响经穴效应的中枢靶点脑区及 其作用机制；运用蛋白组学方法分析靶点脑区的差异蛋白质，采用免疫组化方法 再验证靶效应脑区差异蛋白的分布，深入研究穴位配伍影响经穴效应循经特异 性的中枢整合机制。 （3）得气对经穴效应循经特异性的影响特点及分子响应机制 结合目前国际运用的得气评价方法，设计符合针灸研究应用的得气评价新 体系，并明确不同得气状态对经穴效应循经特异性及其相关通道示踪成像影响 的异同；运用分子生物学技术，揭示得气对经穴效应循经特异性靶器官通道开放、 受体激活和分子级联事件放大效应的影响，从分子水平诠释得气对靶器官环节 产生关键影响的生物学基础。 二、预期目标 （一）总体目标 以中医针灸理论为指导，运用多学科研究方法与手段，进一步证实经穴效应 循经特异性基本规律；揭示经穴效应循经特异性的生物学基础和科学内涵；探讨 针刺手法、穴位配伍、得气对经穴效应循经特异性的影响特点及机制， 为针灸临 床合理选穴配方提供科学依据。 （二）五年预期目标 1、以慢性稳定性心绞痛、原发性高血压为研究载体，运用国际公认的多中心 随机对照研究方法，进一步 证实经穴效应循经特异性基本规律，为针灸临床合理 选穴和国际推广运用提供科学可靠的证据。 2、围绕经穴效应循经特异性局部始动、中枢整合及效应器官响应三个环节， 系统揭示其多环节靶向调节的生物学机制，阐释经穴效应循经特异性的科学内 涵。 3、围绕针刺手法、穴位配伍和得气三个关键影响因素，深入探讨其对经穴效 应循经特异性的影响特点及作用机制，为经穴效应循经特异性的临床运用提供 科学依据。 4、搭建或创新针灸临床研究平台、 针灸机理可视化研究平台、针灸多学科交 叉研究平台及针灸转化医学研究平台，促进针灸机理研究的可视化、系统化、 规 范化和可应用化，提升针灸研究水平。 5、开拓并完善针灸功能基因研究、 针灸表观遗传调控研究、针灸代谢组学研 究等新领域，引导国际针灸研究的新方向。 6、整合多学科研究人员，构建经穴特异性研究国际协作网络，组建一支长期 合作、多学科交叉的创新研究 团队。 7、发 表文章 140-150 篇，SCI 收录文章 40-50 篇，其中 IF的 SCI 收录文章 不少于 5 篇，保持我国经穴特异性研究在国际上的 领先地位。 8、培养硕、博士研究生 60-80 名、教育部新世 纪优秀人才 计划或国家杰出青 年基金获得者 1-3 名，建立一支结构合理的经穴特异性国际合作研究团队。 9、通过 5 年的研究，凝练和提升传统经穴特异性理论，促进针灸学术的传承、 创新和可持续发展。 三、研究方案 （一）总体研究思路 围绕“循经性是 经穴效应特异性的基本表 现形式，针 刺手法、穴位配伍和得 气是影响经穴效应循经特异性的关键因素，局部始动-中枢整合- 效应器官响应多 环节靶向调节是经穴效应循经特异性的生物学基础” 的工作假说， 综合运用临床 疗效评价、分子生物学、功能基因组学、代谢组学、蛋白组学、生物信息学、表 观 遗传学、神 经生物学、生物力学、神 经影像学、脑连接组学、神经电生理学等多学 科研究技术手段，结合中医 针灸学辨证循经、辨位循经的临床实践特色，以原 发 性高血压、慢性稳定性心绞 痛等作为研究载体，从 临 床疗效的角度进一步确证经 穴效应循经特异性基本规律；从局部始动、中枢整合、靶器官响应三个环节，深入、 系统、全面揭示经穴效应循 经特异性的生物学基础；从针刺手法、穴位配伍、得气 三个关键影响因素探讨其经穴效应循经特异性的影响特点及其机制。 （二）技术途径 （三）可行性分析 1、选题符合指南，立项依据充分：本 项目围绕“深入阐明经穴效应循经特异 性基本规律和关键影响因素，揭示经穴效应循经特异性多环节靶向调节的生物 学基础”这一关 键科学问题 开展研究，把握了 针灸学 发展中的关键科学问题。同 时，在前期肯定经穴效应特异性的基础上，深入研究经穴效应循经特异性基本规 律及其关键影响因素，不仅 是应对国际针灸经络研究挑战、抢占国际经穴特异性 研究领先地位具有重要的战略意义，也是开创继针刺镇痛获得国际认同之后又 一新的突破口，对创新经络腧穴理论和提高针灸临床疗效，推进针灸学科的现代 化、国际化等具有重要的科学价值，其立 项依据充分。 2、研究思路清晰，技术路 线可行：本项目以针灸理论与临床的关键科学问题 “经 穴效应循 经特异性基本规律、生物学基础及关键影响因素”为切入点，以体 现针灸辨证循经、辨位循经疗 效确切的疾病慢性 稳定性心绞痛、原发性高血压 和原发性痛经为研究载体，采取传统和现代相结合、多学科交叉的研究方式，在 进一步证实经穴效应循经特异性基本规律的基础上，从局部启动、中枢整合、靶 器官响应环节深入、系统、全面揭示经穴效应循经特异性的生物学基础；从针刺 手法、穴位配伍、得气三个方面探讨经穴效应循经特异性的关键影响因素。其研 究思路清晰，研究目标明确，研究层次清楚，技 术路 线切实可行。 3、研究基础良好，工作积 累深厚：项目组成员研究领域和学科涵盖针灸学、 循证医学、 临床流行病学、神经影像学、代 谢组学、分子生物学、表观遗传学、生 物力学、神经生物学、生物信息学、生物医学工程学等，具有多学科协作研究的 显著特点；项目组成员先后承担了国家“七五” 、“八五 ”、“九五” 、“十五” 科技攻关、973 计划、 “十一五” 支撑计划、国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金重大研 究计划等重大项目的研究工作，取得了一系列研究成果，研究经验丰富、研究基 础雄厚；本项目首席科学家所主持完成的973项目“基于 临床的经穴特异性基础研 究”，通 过运用传统和现代研究的方法已初步证实了 经穴特异性客观存在，相关 科研成果获省部级奖励15 项， 发表相关学术论文680篇，出版相关学术专著27部。 该项目的研究已经在国际、国内产生了广泛的辐射和推动效应，为本项目的完成 提供了坚实的保障。 4、研究条件优越，仪器设备 先进：项目承担单位及各课题单位拥有4个国家 级重点学科，11个省部级重点学科，5个省部级重点 实验室， 5个国家中医药管理 局重点研究室，3个国家中医临床研究基地建设单位， 7个国家中医药管理局三级 科研实验室；拥有功能神经影像、神经电生理、表 观遗传、分子生物、代 谢组、蛋 白质组等本项目研究所需的仪器设备，为项目的实施提供了先进、优越的工作条 件，可充分保障研究工作的顺利实施和完成。 （四）创新点 1、在前期肯定经穴效应存在特异性的基础上，结合针灸辨证循经、辨位循经 的临床特色，率先开展更符合 针灸理论与临床实际的经穴效应循经特异性基本 规律研究，突破了国际经穴特异性研究主要基于辨病开展穴位与非穴位效应差 异的研究思路，与国内外研究相比，研究思路更具创 新性。 2、紧 密围绕“ 局部始动-中枢整合-效应器官响应多环节靶向调节是经穴效应 循经特异性的生物学基础”的假说，率先对“神经-肥大细胞联动、肥大细胞- 微循 环整合、肥大细胞脱颗粒下游分子响应”的局部靶向 调节机制，中枢时空网络整 合机制以及靶器官响应的血管、离子通道、受体、代谢靶标分子机制进行系统、 全面和深入的研究，是国际经 穴特异性机理研究的首次全面探索。 3、针对经穴效应循经特异性的三大影响因素针刺手法、穴位配伍和得气的 不同作用特点，分别研究针 刺手法的分子机制、穴位配伍的中枢网络整合特点、 得气对靶器官分子的放大效应，重点突出，目的明确，有望取得突破性进展。 4、在技术手段上，既运用了形 态学、神 经生物学、分子生物学等还原论方法， 又结合了代谢组学、蛋白组 学等系统生物学的手段；既借鉴了传统、经典学科的 研究方法，又引入功能影像学、在体组织膜片钳、微透析等针灸研究的特色和共 识技术；还首次引入了ChIP-seq 等表观遗传学等新兴 学科领域的技术方法，同时在 各课题设置中充分考虑到正向证明和反向验证，这些方法的综合运用将有利于 促进经穴特异性机理的深入和系统阐明，引导国际针灸研究的创新发展。 5、本项目通过多学科交叉研究，不 仅“经穴效应循经特异性多环节靶向调节 生物学基础” 是整个项目的 总体创新成果，而且，局部启动的靶向调节机制、中枢 时空网络整合及关键分子靶点、针刺手法效应的分子机制、穴位配伍的中枢网络 整合、得气的靶器官分子级联放大机制等研究成果都将是总体创新成果下的具 体化，将对针灸经络理论的发展、 临床疗效的提高等产生深远的影响，与国内外 同类研究相比，其研究结果具有重要的科学意义和临床价值。 （五）课题设置 课题1：经穴效应循经特异性基本 规律临床评价及中枢靶向整合生物学基 础 研究 【研究目标】 （一）总体目标 以慢性稳定性心绞痛、原发性高血压为研究载体，运用国际公认的多中心 RCT 方法和多模 态神经影像及复杂网络分析技术，进一步证实经穴效应循经特异 性基本规律及中枢靶向整合机制，为针灸临床合理选穴和国际推广运用提供科 学可靠的证据。 （二）五年目标 1、以针灸临床确有疗效的慢性稳定性心绞痛、原发性高血压为研究载体，从 临床评价的角度进一步证实经穴效应循经特异性基本规律； 2、以慢性稳定性心绞痛为研究载体，采用多模 态神经影像及复杂网络分析 技术等，揭示经穴效应循经 特异性的中枢网络整合机制； 3、发 表论文 50 篇，SCI 论文 10-15 篇，其中 IF.5 的文章不少于 2 篇；出版专 著 1-2 部； 4、培养教育部新世纪优秀人才计划或国家杰出青年基金 1 人，培养 20-30 名 硕、博士研究生。 【研究内容】 1、经 穴效应循经特异性基本规律临床评价研究 （1）以慢性稳定性心绞痛患者 为研究对象，采用多中心 RCT的临床试验方法， 在基础治疗上分别采用辨位循经取穴、他经取穴、非经非穴的干预方案，系 统评 价经穴效应循经特异性基本规律； （2）以原发性高血压患者为 研究对象，采用多中心随机 对照的临床试验方法， 在基础治疗上分别采用辨证循经及非经非穴的干预方案，系统评价经穴效应循 经特异性基本规律。 2、经 穴效应循经特异性中枢整合机制研究 以慢性稳定性心绞痛为研究载体，综合运用血氧饱和依赖功能磁共振技术 （BOLD-fMRI）和事件相关 电 位（ERP）技术，采集循经取穴针刺与非循经取穴针刺、 非经非穴针刺所引起的大脑神经信息响应时空特征，分别构建循经、非循经、非 经非穴针刺效应的中枢时空网络模型。 【研究方案】 1、经 穴效应循经特异性基本规律临床评价研究 （1）慢性稳定性心绞痛针刺治 疗循经特异性基本规 律临床评价 采用多中心、随机、对照临床研究方法，采用解 释性 试验设计，系统评价辨 位循经取穴、他经取穴、非经非穴的干预方案治疗治 疗慢性稳定性心绞痛的临床 疗效。 研究对象：378 例慢性稳定性心绞痛患者 研究对象的选择： 纳入标准： 符合慢性稳定性心绞痛诊断标准； 年龄在 18 至 80 岁之间； 发病大于 3 个月以上； 冠状动脉狭窄超过 50%，且每周心 绞痛发作次数5 次； 加拿大心血管协会心功能评定量表为 III 级； 药物治疗 3 个月及以上。 排除标准： 近三个月内发展为不稳定性心绞痛或心肌梗死； 心衰患者，加拿大心血管协会心功能评定量表为 IIIIV 级； 伴有其他重要脏器实质性损害的患者，如肺气肿、肝肾功异常 （AST，ALT，GUN 等指标高于正常值 3 倍以上）等； 怀孕妇女； 心电图提示出现其他心脏功能恶化改变。 试验分组：循心经、心包经取穴组：内关、神 门等； 循肺经（他经）取穴组： 列缺、太渊等；非经非穴组：非穴点 1：肘内侧,肘尖与腋窝连线中点。非穴点 2： 肱骨内上髁与尺骨腕部之间中点，尺侧缘等。 观察指标： 主要结局指标：每周心绞痛发作次数：采用日记方式，记录心绞痛患者每 周心绞痛发作次数。 次要结局指 标： 心电图运动负荷时间：运用动态心电图监测患者在活动平板上进行负荷 运动，直到 ST 段压低 0.1mA 的时间。 心绞痛程度评价：采用 VAS 评分模式， 记分从 010，分值越低，疼痛程 度越轻。 ST 段最大 压低值：评价患者在运动负荷时，心电图监测显示的 ST 段降低 的最大值。 生活质量评分 （2）原发性高血压针刺治疗 循经特异性基本规律临 床评价 采用多中心随机对照临床研究方法，采用解释性试验设计，系统评价辨证循 经及非经非穴的干预方案治疗治疗原发性高血压的临床疗效。 研究对象：309 例原发性高血压患者 研究对象的选择： 纳入标准： 原发性高血压患者在停用降血压药物后血压维持在 140/90mmHg 和 179/109mmHg 之间； 18 岁以上患者； 近 6 个月以来没有接受 过针灸治疗； 没有停用降压药物的禁忌症； 入组前 2 个月内没有更 换过降压药物或者没有接受 药物治疗。 排除标准： 24 小时动态血压监测发现收缩压峰值高于 220mmHg，舒张压峰值高于 115 mmHg 的患者； 继发性高血压患者； 重要脏器损害，监测指标高于正常值 3 倍； 伴有糖尿病、心衰、脑血管意外、心肌梗死、肿瘤等重大疾病的患者。 试验分组：辨证循经取穴组；非辨证循经取穴组 ；非经非穴组； 观察指标： 主要结局指标：24 小时内血压均值。使用动态血压监测患者 24 小时内的 收缩压和舒张压，计算 24 小时内的均值。 次要结局指 标： 白天和夜晚的血压均值。分别计算白天和夜晚患者的收缩压和舒张压均 值 血压峰值。使用动态血压监测观察患者 24 小时内血压，记录血压最高值。 血压改善值。随访点的血压均值和基线期血压均值的差值。 血压昼夜节律、血压变异性等。 2、经 穴效应循经特异性中枢整合机制研究 以60例符合纳入标准的慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，随机分为循 经取穴组（内关等）；循他 经取穴组（列缺等）；非经非穴组；等待治疗组， 每组15人，分别采集针刺治疗前后的影像数据，采用复杂网络分析等方法研究不 同取穴针刺治疗前后脑功能响应的差异，并采用相关分析融合影像数据与临床 治疗数据，分析脑功能响应 和临床疗效的相关性，深入探讨经穴效应循经特异性 的中枢网络整合机制。 【承担单位】成都中医药大学、西安电子科技大学、南京中医药大学 【课题负责人】唐勇 【经费比例】32% 课题2：经穴效应循经特异性局部启 动靶向调节生物学基 础研究 【研究目标】 （一）总体目标 以慢性心肌缺血动物模型为研究载体，观察针刺对穴区组织内肥大细胞、神 经电活动、微循环及肥大细 胞脱颗粒后分子事件的影响，探讨经穴效应循经特异 性的局部肥大细胞相关始动及传入机制。 （二）五年目标 1. 以慢性心肌缺血动物模型为研究载体，观察针刺对穴区组织内肥大细胞、 神经电活动、微循环及肥大 细胞脱颗粒后分子事件，探讨经穴效应循经特异性的 局部肥大细胞相关始动及传入机制； 2. 以健康受试者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，观察不同穴位皮内 微血管自律性舒缩活动的异同及针刺对微循环单位的影响，探讨经穴效应循经 特异性的局部微循环始动及传入机制。 3. 以上海市针灸经络研究中心为基地，与国内外有关组织合作，吸引更多 的一流科学家和科研机构投入到中医基础理论研究中，建立多学科开放式针灸 经络现代研究平台，培养高水平具有国际视野、掌握相关现代科学技术的针灸经 络研究人才。为加强我国在 针灸经络研究方面的国际学术地位奠定基础。 4. 发表核心期刊学术论文40篇，SCI杂志收录15篇，其中影响因子4的3篇； 培养博士研究生10名以上，并注意研究队伍建设，锻炼出一支多学科高水平研究 队伍，形成合理的人才梯队 ，培养 优秀年轻人。 【研究内容】 1、肥大细胞等与经穴效应循经特异性的相关性研究 （1）以慢性心肌缺血动物模型 为研究载体，采用在体 组织膜片钳等技术， 观 察针刺对肥大细胞膜上的钙、氯通道的影响，探 讨针刺产生的应力调控作用机制； （2）以动物模型为研究载体，运用离体肥大细胞在不同剪切速率、方向、振幅 下，发现 机械力刺激导致TRP通道开放的规律，采用剔除TRP通道蛋白上不同蛋白 段的肥大细胞，重复实验，确定其物理机制，研究循经取穴、他经穴和非经非穴 胶原纤维在不同应力参数刺激下的生物物理特性变化，阐明机械和电刺激产生 不同的始动信号与疗效的关系； （3）以动物模型为研究载体，通过剔除神经纤维和肥大 细胞之间的连接蛋白 基因，观 察针刺对神经启动 信号的影响，研究肥大 细 胞和神经纤维的细胞膜和化 学物质的关联关系，以及这 种关联对针刺信号在向神经系统转移中的重要作用， 获得针刺有效信号的启动与传入特征； （4）以动物模型为研究载体，通过调节穴位处化学物 质浓度、拮抗或激活相 应受体对有关传入神经放电以及针刺穴位引起的脏腑效应的影响，研究肥大细 胞脱颗粒下游分子事件、肥大 细胞- 微循环关联、揭示肥大细胞相关分子及肥大细 胞-微循 环靶向整合的机制。 2、经 穴区微血管自律性舒缩活动的循经特异性研究 以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，分别比较经穴与非经 非穴、同一经脉不同穴区、以及不同经脉穴位区皮内微血管自律性舒缩活动的特 异性、共性和差异性，揭示经穴区皮内微血管自律性舒 缩活动的循经特异性。 【研究方案】 1、肥大细胞等与经穴效应循经特异性的相关性研究 （1）拟采用心肌缺血大鼠模型，分 别用定量手针仪和 电针仪两种不同模式的 针刺工具刺激实验动物穴位，以心电变化、血 压变化、痛阈提高等作为效应指标。 同时对穴位处进行微透析，采用高效液相分析方法研究针刺前后穴位处腺苷类 等化学物质的变化水平与针刺效应之间的关系。循经穴位处组织染色观察肥大 细胞的形态，研究腺苷类物质在针刺过程中的变化与肥大细胞脱颗粒之间的联 系。 （2）拟通过基因手段培养TRPV2蛋白缺失的小鼠，以同窝野生型为对照，结合 局部注射特异性拮抗剂观察针刺内关穴区等对心脏电活动的影响，阐明穴位处 该基因蛋白在经穴效应循经特异性中的作用。 、3、 利用人体肥大细胞系（HMC-1）的培养，通过平行板流动腔技术，施加 切应力刺激，模拟循径组织 液流动状态下的环境因素，使用钙荧光技术对细胞内 的钙离子浓度进行实时测量，考察人体肥大细胞在不同形式的切应力刺激激活 率的变化。同时，采用TRPV2蛋白的特异性拮抗剂，屏蔽肥大细胞膜上TRPV2蛋白， 进一步研究肥大细胞在切应力刺激下激活的分子基础。 、4、 应用粗外电极记录方法，记录不同针刺手法诱发的外周传入神经电 活动信号时域和频域的变化，同时利用形态学方法观测针刺循经穴位区肥大细 胞脱颗粒的变化。运用肥大 细胞膜稳定剂或激动剂，分别屏蔽或促进穴位区或非 经非穴区的肥大细胞脱颗粒，同时观察传入神经电活动信号的变化，从而研究循 经肥大细胞与针刺传入信号之间的相互关系，及其在针刺效应中的作用。 、5、 实时记录心肌细胞膜上的钙通道、钠钙交换蛋白和钠钾泵的功能活 性随着细胞外液的改变（即在不同的血清条件下）所发生的变化，由此揭示针刺 通过体液因素影响心肌细胞膜钙转运系统，降低心肌细胞内钙离子浓度的靶蛋 白，为进 一步阐明其中的机制提供有力的证据。 、6、 运用神经元-肥大细胞共培养模型，研究多 细 胞神经免疫系统生物信 息的双向交流，针对穴位的解剖学特性，拟选用大鼠背根神经节内的感觉神经元 和大鼠腹腔肥大细胞建立共培养模型。利用该模型在细胞水平上研究机械力、温 度及低强度激光照射对两者之间信息交流的影响，为针灸的机制提供理论基础。 、7、 利用模式细胞作为异源基因表达系统，通过细胞分子生物学技术将 与慢性心肌缺血相关的细胞膜蛋白基因筛选出并表达在模式细胞膜上，再利用 细胞电生理技术，研究这些 细胞过表达外源性基因后，它们对刺激的敏感性，有 利于了解针刺治疗慢性心肌缺血的细胞分子机制。 、8、 通过心肌缺血的动物模型，用电生理、 RNA干 扰、基因过表达等多种 技术研究：针刺是否部分通过DOR和其它相关受体活动的改变而减轻缺血心脏的 损伤和异常兴奋性；DOR表达的增加或减少是否影响该针刺效应；针刺通过DOR 保护心脏的细胞内信号通路。揭示针刺减轻缺血性心脏损伤、减少心律失常的外 周机制。 、9、 通过在心肌缺血的动物模型，用电生理和分子生物学技术探索：心肌 缺血如何影响脑干心血管神经元的活动；心肌缺血时针刺对脑干心血管神经元的 影响；该针刺效应是否有赖于DOR和通道蛋白的整合调节及特定膜-胞信号的传递。 进一步揭示针刺减轻缺血性心脏损伤、减少心律失常的中枢机制。 、10、 通过共聚焦显微镜上加装双激光系统，研究针刺的应力等刺激因素 对肥大细胞胞内pH值变化的影响。结合研究模型动物在患本病前后、针刺治疗前 后H+浓 度的变化趋势，开展比较研究，研究影响pH值变化的机制，探索通过何种 生化产物， 诱导肥大细胞表面的钙离子通道的开放，从而使得胞内钙离子浓度增 加，并导 致脱颗粒。进一步研究钙离子通道结构及其开启功能的关联性，并以此 解释针刺手法和钙离子通道开启的关系。 、11、 研究细胞外基质中透明质酸分子量、浓度对肥大细胞的TRPV钙离子 通道开闭以及脱颗粒的影响。研究应力与压力等刺激对多糖水凝胶网络体系的 粘弹性的影响，和对靶细胞的作用机制，分析透明质 酸受体的影响。 2、经 穴区微血管自律性舒缩活动的循经特异性研究 （1）经穴区皮内微血管自律性舒 缩活动的特异性研究 以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，每条经脉选择 10 个穴 位，并在穴位旁开 1 厘米处任意一点作为对照，利用激光多普勒微循环血流仪同 步监测、 记录穴位与对照点的皮内微循环血流情况，分析比较经穴区相对于非经 穴区皮内微血管自律性舒缩活动的特异性。 （2）同一经脉不同穴位区皮内微血管自律性舒 缩活 动的共性研究 以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，在同一经脉上，选取至 少 4 个穴位，这些穴位相距较远、处于不同的神经节 段分布区、或为躯体对侧的 同名穴，两两组合，利用激光多普勒微循环血流仪，同步监测、记录其皮内的血 流变化情况，分析比较同一 经脉不同穴位间皮内微血管自律性舒缩活动的频率 是否相同。 （3）不同经脉穴位区皮内微血管自律性舒 缩活动的差异性研究 以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，研究涉及全部经脉，利 用两两比较方法，即在同一神 经节段区的不同经脉上选取一对穴位，利用激光多 普勒微循环血流仪，同步监测 、记录其皮内的血流变 化情况，分析不同 经脉穴位 间皮内微血管自律性舒缩活动的频率是否相同。 （4）针灸对施术区经穴皮内微血管自律性舒 缩活动 的影响研究 以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，分别利用针刺、艾灸等 方法刺激穴位，利用激光多普勒微循环血流仪， 监测 、记录刺激前后穴区皮内的 血流变化情况，分析比较刺激前后，得气穴位的皮内微血管自律性舒缩活动的振 幅是否提高。 （5）针灸对同一经脉上其它 经穴区皮内微血管自律性舒 缩活动的影响研究 以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，分别利用针刺、艾灸、 穴位导入提高微血管自律性舒缩活动振幅药物等方法刺激穴位，利用激光多普 勒微循环血流仪，同步监测、 记录刺激前后该经脉上其它穴位区、与该经脉相邻 的其它经脉线上穴位区皮内的血流变化情况，分析比较刺激前后，所监测穴位的 皮内微血管自律性舒缩活动的振幅是否提高。 （6）针灸对躯体对侧同名经 脉上穴区皮内微血管自律性舒 缩活动的影响研究 以健康志愿者和慢性稳定性心绞痛患者为研究对象，分别通过针刺、艾灸、 穴位导入提高微血管自律性舒缩活动振幅药物等方法刺激穴位，利用激光多普 勒微循环血流仪，同步监测 、记录躯体对侧同名穴位及与该穴相邻的非同一经脉 上穴位的血流变化情况，分析比较刺激前后，所 监测 穴位皮内微血管自律性舒缩 活动的振幅是否提高。 【承担单位】上海市针灸经络研究中心、北京农学院 【课题负责人】丁光宏 【经费比例】17% 课题3：经穴效应循经特异性靶器官响 应的生物学基 础研究 【研究目标】 （一）总体目标 1、以慢性心肌缺血模型为研究载体，揭示 经穴效应循经特异性靶器官血流 动力学响应模式及特征； 2、以慢性心肌缺血模型为研究载体，揭示 经穴效应循经特异性靶器官离子 通道响应模式及特征； 3、以慢性心肌缺血模型为研究载体，揭示 经穴效应循经特异性靶器官受体 响应模式及特征； 4、以慢性稳定性心绞痛和/ 或高血压为研究载体，揭示经穴效应循经特异性 靶器官分子响应特征。 （二）五年目标 1、明确经穴效应循经特异性在心脏器官水平的响应 特征； 2、观 察针刺对心脏细胞膜钙离子通道及相关蛋白，揭示经穴效应循经特异 性心脏离子通道响应模式及特征； 3、 研究针刺对心脏活动、心脏肾上腺素 -受体、毒蕈碱 M2 受体及 1-AR 和 M2 受体后信号成份 cross-talk 的影响，揭示 经穴效 应循经特异性靶器官受体响 应模式及特征； 4、 建立慢性心肌缺血小型猪动物模型；形成 CT 冠状动脉成像、双能心肌灌 注技术、左心室功能评估一站式影像学检查动物猪方法； 5、 与列缺穴及非经穴点对照，电针内关穴治疗慢性心肌缺血小型猪 4 周前 后分别行心脏 CT 灌注疗效 评估、观察蛋白组学及分子生物学方面变化，初步揭 示电针动物内关穴对心肌缺血的循经特异性； 6、 揭示循经取穴针刺治疗心肌缺血和/或高血压靶器官分子响应特征； 7、 发表论文 20-30 篇，其中 SCI 论文 3-5 篇、 影响因子5 的 1-2 篇；培养博、 硕士 10 名，锻炼出一支高水平的研究队伍，形成合理人才梯队，培养出一批年轻 的优秀科研人员。 【研究内容】 1、循经取穴针刺病理状态下心脏血流动力学响应特征研究 分别以轻中度稳定性心绞痛患者和慢性心肌缺血小型猪为研究对象，采用 第二代双源CT双能量心肌灌注成像技术，动态观察针刺对慢性心肌缺血病人和 慢性心肌缺血小型猪的心肌灌注、左心室功能变化影响的规律，明确经穴效应循 经特异性在心脏器官水平的响应特征。 2、循经取穴针刺病理状态下心脏离子通道响应特征研究 采用酸敏感离子通道（ASIC2-/- ，ASIC3-/-）基因敲除小鼠 为载体，运用免疫印 迹、定量PCR技术结合膜片钳电生理技术，观察针刺 对心脏细胞膜钙离子通道及 相关蛋白，揭示经穴效应循 经特异性心脏离子通道响应模式及特征。 3、循经取穴针刺病理状态下心脏受体响应特征研究 以慢性心肌缺血动物模型、特异性靶向心血管肾上腺素能1受体特异性基 因敲除小鼠（Adrb1tm1Bkk）及毒蕈碱M2 受体特异性基因敲除小鼠（由北京维通利华 生物制品有限公司提供）为载体，运用免疫印迹、电 生理技术，从正、反两方面研 究针刺对心脏活动、心脏肾 上腺素 -受体、毒蕈碱M2 受体及 1-AR和M2 受体后信 号成份cross-talk 的影响，揭示经穴效应循经特异性靶器官受体响应模式及特征。 4、循经取穴针刺病理状态下心脏分子响应特征研究 采用 ChIP-seq、代谢组学及分子生物学等技术，研究循经针刺对心肌组织中 基因表达水平、心肌表观遗传 学- 组蛋白修饰的改变 ，以及血 浆代谢产物、心脏组 织代谢产物谱的影响，揭示 经穴效应循经特异性靶器官响应分子基础。 【研究方案】 1、循经取穴针刺病理状态下心脏血流动力学响应特征研究 （1）电针调节缺血心脏功能活 动自主神经及交感活 动相关体液因素分析 在特异性靶向心血管肾上腺素能 1/2 能受体基因敲除小鼠上，观察针刺 对心脏活动的影响；采用 电生理法记录 ECG，分析心率变异性和平均动脉压， 观察电针内关穴区等对急性心肌缺血动物和患者自主神经活动的影响；与列 缺穴及非经穴点对照，采用双源双能 CT 心肌灌注成像动态观察电针内关穴治疗 前后对慢性心肌缺血小型猪、慢性心肌缺血病人心功能及心肌灌注血流动力学 的影响，包括蛋白组学肽质 量指纹图，分子生物学 检查 ERK1/2、p-ERK1/2 等的变 化。 2、循经取穴针刺病理状态下心脏离子通道响应特征研究 （1）延脑-脊髓-神经节心交感控制通路在 针刺调节缺血心脏功能活动中的作 用 以肾上腺素能 1/2 受体基因敲除小鼠（Adrb1tm1Bkk、Adrb2tm1Bkk/J）、中华小 型猪和环扣式慢性心肌缺血（MI）动物模型为研究对 象， 采用 Western blot、 real- time-PCR 等技 术进行延脑 腹外侧区口侧区（rVLM ）内 脏前运动神经元群作用分析； 检测调节心交感活动的物质表达水平，如：一氧化氮合酶（NOS， NOS II gene）、腺 苷受体（A(1) R）、胆碱能毒蕈碱 M2、M4 受体等的表达；检测脊髓侧角（中间内 侧神经元柱,和中央管周围 自主区）组胺 5-HT(3) 受体、 AT1R、NOS II、beta1-AR 表 达； 检测星状神 经节酪氨酸 羟化酶（TH ）、去甲 肾 上腺素转运体（NET）、 nNOS 和 beta1-AR 表达。 （2）延脑-节状神经节-心迷走通路在 针刺调节缺血心脏功能活动中的作用 分别以特异性心血管胆碱能M2/M4基因敲除的小鼠、毒蕈碱M2/M4受体基因 敲除小鼠为研究对象，研究 胆碱能神经在针刺调节性功能活动中的作用分析； 在特异性心血管胆碱能 M2/M4基因敲除的小鼠上，记录心电活动，观察针刺对 心脏功能活动的影响；NA-迷走神经背核（DMV ）区、NTS作用分析。 （3）针刺对缺血心肌左心室肌 细胞肾上腺素能相关活 动调节的细胞分子机制 分别以特异性心血管胆碱能 M2/M4 基因敲除的小鼠、毒蕈碱 M2/M4 受体基 因敲除小鼠为研究对象，研究 减少 NE 释放的物质；促进 NE 释放的物质； 细胞介质； 缓激肽（bradykinin， BK）B2-受体（激活 AT1R）、辣椒素受体（TRPV1）蛋 白表达；针 刺改善心肌缺穴与 细胞内信号转导通路活 动关系的分析。 （4）循经取穴对缺血心肌细 胞膜钙离子通道及相关蛋白活 动的影响 分别以特异性心血管胆碱能 M2/M4 基因敲除的小鼠、毒蕈碱 M2/M4 受体基 因敲除小鼠为研究对象，采用 Western blot、定量 PCR 技术结合膜片钳电生理记录 离体心肌细胞膜离子通道的工作观察电针预处理对缺氧心肌细胞膜离子通道的 作用，分析针刺改善缺血心肌 细胞膜活动的机制。 （5）星状节等交感神经节、脊髓胸段内参与针刺调节 缺血心脏功能活动的差 异蛋白谱分析 采用双向电泳、质谱、基质辅助激光解析离子化系统结合同位素标记技术检 测参与针刺改善心肌缺血的差异蛋白表达谱。 3、循经取穴针刺病理状态下心脏受体响应特征研究 以肾上腺素能 1 受体基因敲除小鼠（Adrb1tm1Bkk ）和特异性心血管胆碱能 M2 基因敲除小鼠 为研究对象： （1）分别采用受体结合实验 或 Western blot 观察比较 心肌细胞 1-受体、M2/M4 受体的数量及亲和力或含量，并以荧光染料 Fura-2 为钙标记，测量单个心肌细胞 内钙对 1-受体激动剂 Dobutamine 的反应性，以探讨心脏靶器官 1-受体、M2/M4 受体的数量/亲和力或反应 性是否参与介导了循经取穴抗心肌缺血效应的特异性； （2）采用 Western blot 方法测定心肌细胞 Gs-蛋白含量，以探讨 1-受体、M2/M4 受体后信号成分Gs- 蛋白是否参与介 导了经穴效应 循经特异性； （3）测量单个心肌细胞内钙对 腺苷酸环化酶（AC ）激动剂-forskolin 的反应性， 以探讨 1-受体、M2/M4 受体后信号成分 AC 是否参与介导了经穴效应循经特异 性； （4）采用 ELISA 法测定心肌 cAMP 含量，以探讨 1-受体、M2/M4 受体后信号成 分cAMP 是否参与介导了经穴效应循经特异性； （5）测量单个心肌细胞内钙对 PKA 激动剂 DB-cAMP 的反应性，以探讨 1-受 体、M2/M4 受体后信号成分PKA 是否参与介导了经穴效应循经特异性； （6）测量单个心肌细胞内钙对钙 通道激动剂Bay-K8644 的反应性，以探讨 1-受体、M2/M4 受体后信号成分 钙通道是否参与介 导了经穴效应循经特异性。 4、循经取穴针刺病理状态下心脏分子响应特征研究 （1）经穴效应循经特异性表 观遗传分子调控机制研究 动物实验 模型：犬心肌缺血再灌注模型 分组：空白组、空白+针 刺组，模型 组、模型+针刺组 穴位选择：内关 刺激参数：2HZ，20 分钟，每日一次，连续 7 天 观察指标：心电图和心率、血压；心肌缺血面积测量；心肌组织中基因表 达水平的检测（运用荧光定量 PCR、生物芯片等分子生物学技术结合检 测）；心肌表观遗传学-组蛋白修饰的改变 H3K4me3（activated）、H3K27me3 （inactivated）的 ChIP-seq 临床试验： 分组：健康组、慢性稳定性心绞痛患者、慢性 稳定性心绞痛患者+ 针刺组 病人诊断纳入、排除等标准：同临床研究 样本量：每组患者 10 例 针刺穴位：内关 刺激参数：同临床研究 指标检测：效应指标：症状评价、心电图等；表观遗传调控：外周血中性粒 细胞 ChIP-seq （2）经穴效应循经特异性代 谢分子调控机制研究 分别以符合纳入标准的慢性稳定性心绞痛患者和原发性高血压患者为研究 对象，每种疾病纳入 60 例受试者。采用 NMR 等方法 对血样分别采集弛豫滤波和 扩散滤波的谱图，对组织样 本分别进行水溶性和脂溶性样本进行 NMR 代谢组学 谱观察， 进行：代谢组学高通量数据的生物信息学分析；生物标记物识别； 经 穴效应特异性基本 规 律的生物分子网络研究。 【承担单位】中国中医科学院针灸研究所、辽宁中医药大学、成都中医药大学 【课题负责人】荣培晶 【经费比例】16% 课题4：穴位配伍对经穴效 应循经特异性的影响特点及中枢整合机制 【研究目标】 （一）总体目标 1、以原发性高血压患者为研究对象，基于循 经取穴配伍原则，展开穴位配伍 的研究，从 PET、fMRI 脑功能成像角度，分析循经取穴配伍对于经穴效应循经性 的影响，从脑对穴位针刺信号的整合，探讨穴位配伍影响经穴循经效应的机制。 2、以自发性高血压大鼠为研究对象，基于循 经取穴配伍原则，展开穴位配伍 的研究，用 PET-CT 结合 fMRI 脑扫描确定经穴激活的关 键靶效应脑区，用蛋白组 学方法分析靶效应脑区的差异蛋白质，用全基因表达 谱 芯片分析经穴循经取穴 配伍对自发性高血压大鼠关键靶效应脑区基因表达差异，用抗体芯片 检测经穴 循经取穴配伍对自发性高血压大鼠靶效应脑区炎症因子的影响，从宏观和微观 水平紧密结合起来阐明循经取穴配伍对于经穴效应循经 特异性的中枢整合机制。 （二）五年目标 1、以健康志愿者、原发性高血 压患者为研究对象，分析健康和病理状态下， 以太冲为主的本经穴位配伍、表里经穴位配伍、同名经穴位配伍、非穴配伍 对于 脑部功能区葡萄糖代谢和血流状态的影响。 2、以自发性高血压大鼠为研究对象，通过 PET-CT、fMRI 脑扫描、iTRAQ 技术、 全基因表达谱芯片分析以及抗体芯片分析深入阐述穴位配伍影响经穴效应循经 特异性的中枢整合机制。 3、建立穴位配伍对经穴效应循经特异性研究的平台技 术体系， 进一步强化 穴位配伍对穴位效应循经特异性的中枢机制研究，并争取实现穴位配伍对经穴 效应循经特异性靶标或新的生物标记物的自主创新。 4、发 表影响因子大于 5 的 SCI 刊物上发表学术论文 4-5 篇左右，申报专利 1- 2 项；培养博士后和博士研究生，造就一支 结构合理、具备攻坚能力的国际先进水 平的研究队伍。 【研究内容】 1、穴位配伍对经穴效应循经特异性的影响特点研究 以原发性高血压患者为研究对象，采用RCT 临床研究方法，观察不同配伍方 案（以太冲为主穴，观察本 经配穴、表里 经配穴、同名经配穴、非穴配伍）针刺降 压效应差异，探讨穴位配伍 对经穴效应循经特异性的影响特点。 2、穴位配伍影响经穴效应循经特异性的中枢整合机制 （1）以原发性高血压患者为 研究对象，采用fMRI/PET-CT多模态神经影像技术， 观察不同配伍方案针刺对脑部功能区葡萄糖代谢和血流状态的影响，探讨不同 循经取穴配伍状态下特异性变化脑区及中枢整合机制。 （2）以自发性高血压动物模型（ SHR）为研究对象，采用PET-CT成像技术观察 本经穴位配伍、表里经穴位配伍、同名经穴位配伍、非穴配伍对脑部功能区葡萄 糖代谢和血流状态的影响，并 筛选经穴特异性的关键靶点脑区；对不同配伍治疗 方案治疗后关键靶点脑区进行蛋白组学分析、全基因表达谱系分析和炎症因子 的抗体芯片分析，以深入研究穴位配伍影响经穴效应循经特异性的中枢分子整 合机制。 【研究方案】 1、穴位配伍对经穴效应循经特异性的影响特点研究 采用随机、对照研究方法，研究不同穴位配伍 针刺对原发性高血压患者降压 效应的影响。 研究对象：150 例原发性高血压患者 研究对象的选择：纳入标准和排除标准同课题 1； 试验分组：本经取穴组 ：太冲； 本经配伍组：太冲、曲泉；同名经配伍 组：太冲、内关；表里经配伍组：太冲、 风池；非穴配伍：太冲、非穴。 观察指标：分别在针刺留 针 1 min、5 min、10 min、20 min、30 min 等 5 个时间 点测量患者肱动脉舒张压和收缩压。分别在针刺留针 1 min、5 min、10 min、20 min、30 min 等 5 个时间点行捻 转平补平泻法 30s 后即刻，测量患者肱动脉舒张压 和收缩压。 2、穴位配伍影响经穴效应循经特异性的中枢整合机制 （1）健康青年志愿者经穴循 经取穴配伍的脑功能成像研究 以 100 名健康青年志愿者为研究对象，随机分为空白对照组、太冲穴针刺组、 曲泉穴针刺组、风池穴针刺 组、内关穴 针刺组、非穴 针刺组、本经配穴针刺组（太 冲+ 曲泉）、同名经配穴针刺 组（太冲+内关）、表里 经 配穴针刺组（太冲+ 风池）、非 穴配穴针刺组（太冲+非穴），每 组 10 人，接受 fMRI 和 PET-CT 扫描，观察不同穴位 配伍对脑部功能区葡萄糖代谢和血流状态的影响，选取适当的“ 种子点”开展功能 连接的分析研究，找出关键 作用脑区。 （2）原发性高血压病患者经 穴循经取穴配伍的脑功能成像研究 以 290 名肝阳上亢型原发性高血压患者为研究对象，随机分为空白对照组、 太冲穴针刺组、曲泉穴针刺 组、 风池穴针刺组、内关穴针刺组、非穴针刺组、本 经配穴针刺组（太冲+曲泉）、同名 经配穴针刺组（太冲 +内关）、表里经配穴针刺 组（太冲+风池）、非穴配穴 针刺组（太冲+非穴），每 组 10 人，分别接受 fMRI 和 PET-CT 扫描，观察不同穴位配伍针刺治疗前后对脑 部功能区葡萄糖代谢和血 流状态的影响，选取适当的 “种子”开展功能连接的分析研究，找出关键作用脑 区。 （3）循经取穴配伍对自发性高血 压大鼠关键靶效应脑 区的差异蛋白组学研 究 以 180 只自发性高血压大鼠（SHR）为研究对象，随机分为太冲穴针刺组、曲 泉穴针刺组、风池穴针刺组 、内关穴 针刺组、非穴针 刺组、本经配穴针刺组（太冲 +曲泉）、同名经配穴针刺组 （太冲+内关）、表里 经配穴 针刺组（太冲+ 风池）、非穴 配穴针刺组（太冲+非穴），每 组 20 只。同周 龄正