tgfβ1诱导肺泡上皮细胞间质转化

TGF-1 诱导肺泡上皮细胞间质转化 作者：黄振杰,郑金旭,莫凯天,苏石芳 作者单位：广西北海市人民医院呼吸科;江苏大学附 属医院呼吸科;上海市第八人民医院消化科 【摘要】 目的：通过观察 TGF- 1 诱导下 A549 细胞出现的细胞形态学和 E-cad 表达的 变化，探讨上皮细胞-间质细胞转化 (epithelial-mesenchymal transition,EMT)过程在肺纤维化 发病机制中的作用。方法：体外培养 A549 细胞，以 TGF- 1 进行干预，收集不同时段的细 胞，应用荧光实时定量 PCR(RT-PCR)检测 TGF- 1 干预前后 E-cad 的 mRNA 表达变化;倒置 相差显微镜观察细胞形态学的变化;间接免疫荧光观察 E-cad 蛋白表达的变化。结果：倒置 相差显微镜观察到 TGF- 1 干预后 A549 细胞由鹅卵石状变为梭形，形态如同肌纤维母细胞。 间接免疫荧光显示 A549 细胞的 E-cad 表达( 红色荧光染色)随时间延长逐渐减少。RT-PCR 显示 E-cad 的 mRNA 表达下调(P 0.05)。结论：TGF- 1 在体外诱导肺泡上皮细胞向间质细 胞转化,肺泡上皮细胞间质转化是肺纤维化的重要发病机制之一。 【关键词】 转化生长因子 1,A549 细胞,上皮细胞间质转化,肺纤维化 Abstract：ObjectiveBy observing the cellular morphology changes and the expression of E- cad after A549 cells were treated with transforming growth factor 1(TGF- 1)，to investigate the role of epithelial-mesenchymal transition (EMT) in the pathogenesy of pulmonary fibrosis.MethodA549 cells cultured in vitro were treated by TGF- 1,then harvested at different time points to assay mRNA expression of E-cad by real-time PCR (RT-PCR) before and after A549 cells being treated by TGF- 1.Cellular morphology changes were observed by phase- contrast microscope.Protein expression of E-cad by indirect immunofluorescence.ResultsAfter being treated by TGF- 1，A549 cells were observed by inverted phase contrast microscope to turn from pebble shape to fusiform shape，a myofibroblast-like morphology.Indirect immunofluorescence showed protein expression of E-cad reduced as time went by(red stain).The mRNA expression of E-cad was down -regulated in RT-PCR(P 0.05).ConclusionTGF- 1 induced EMT of alveolar epithelial cells in vitro suggests that EMT of alveolar epithelial cells might be one of fundamental mechanisms of pulmonary fibrosis. Key Words:Transforming growth factor A549 cells;Epithelial- mesenchymal transition;Pulmonary fibrosis 特发性肺纤维化(IPF) 是最常见的肺间质疾病,也是肺间质纤维化的主要原因。多数肺间 质疾病病因不明,其发病机制目前也未完全阐明。传统观点认为各种损伤因素损伤肺泡上皮 细胞和毛细血管内皮细胞，炎症细胞浸润，细胞因子失衡，肺实质损伤后继发肺间质细胞 增殖过度修复导致纤维化。国外有文献报道 IPF 是一种涉及异常创伤愈合的功能紊乱，进 行性的上皮损伤和(或)激活可能处于纤维形成和间质细胞增殖的核心位置，这种作用是不 依赖于炎症的1-2。肺泡上皮细胞 (AECs)不仅仅是作为发病的促动因素，它们本身就可以 通过一个叫做上皮细胞-间质转化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT) 的过程获得间质 细胞表型而作为成纤维细胞和肌纤维母细胞的重要来源。在这个新的模式中，肺泡上皮应 该被看作纤维化的关键环节之一，它作为一个 多能 的干细胞具有相当的可塑性，能参与 到交替的途径中：上皮再生修复正常的肺泡结构，凋亡，或者通过 EMT 形成纤维化。本 研究通过用 TGF- 1 诱导 A549 从肺泡上皮细胞向间质细胞转化，进一步探讨肺泡上皮细胞 在肺纤维化发病中的作用,为阐明肺纤维化发病的分子生物学机制及寻求新的治疗方法提供 依据。 1 材料与方法 1.1 主要试剂及物品：A549 细胞株( 中国典型培养物保藏中心 )，TGF- 1(PeproTech 公司)， E-cad 鼠抗人一抗(Santa Cruz 公司), 兔抗鼠 Fitc 标志的 IgG(Boster 公司) ，胎牛血清 (Hyclone 公司)，低糖 DMEM 培养基(GIBCO 公司)。MMLV 逆转录酶(美国 Promega 公司)， 实时定量试剂盒 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG (Invit rogen 公司)。 1.2 主要仪器：超净工作台(苏州安泰空气技术有限公司 )，二氧化碳培养箱 (Forma)，倒 置相差显微镜(OLYMPUS) ，高速台式离心机 (上海飞鸽牌)，Mx-3000P 实时定量 PCR 仪 (STRATAGENE 公司)，凝胶成像与分析系统 YNGENE (GENE)，电泳仪 Jim-X(Bio-Rad)， 荧光显微镜(Leica)，荧光倒置相差显微镜(Nikon) 。 1.3 细胞培养：A549 细胞用含 10%胎牛血清的低糖 DMEM 培养基，常规培养于 5%的 CO2,37人工培养箱中，细胞呈贴壁生长。 1.4 倒置相差显微镜观察细胞形态：当细胞生长融合至 70%80% ，用无血清培养基饥 饿 24 h,换新鲜培养液,随机把细胞分组，于培养液中加入 TGF- 1 至终浓度 5 ng/ml。倒置相 差显微镜观察 A549 细胞在 TGF- 1 刺激 0、24、48 h 的形态变化。 1.5 间接免疫荧光：以每孔 1 104 个细胞接种于 24 孔培养板中预置的载破片上，细胞贴 壁爬片后，用无血清培养基饥饿 24 h 后，加入 TGF- 1 至终浓度 5 ng/ml。分别于 0、24、48 h 后，取出载玻片，用 4%多聚甲醛固定 60 min。5% 的 BSA 封闭，37 60 min。 加一抗 E-Cadherin 单克隆抗体(1 50)， 4过夜。加相应二抗，缓冲甘油封片。荧 光显微镜下观察，并拍照。 1.6 总 RNA 抽提及逆转录反应：当细胞生长融合至 70%80% ，用无血清培养基饥饿 24 h,换新鲜培养液,在无血清培养基中加入 TGF- 1 至终浓度 5 ng/ml。分别于 0 、1 、3 、6 、12 和 24 h 从六孔板中离心收集细胞,加入 1 ml TRIzol Reagent,按其说明书操作步骤 提取总 RNA,电泳证实,具有清晰 18S 和 28S 条带的 RNA 用于逆转录实验,取 1 gRNA 经 MMLV 逆转录酶逆转录成 cDNA。具体操作按试剂盒说明书进行。cDNA 产物于-20保存。 1.7 实时荧光定量逆转录-聚合酶链反应( Real-time PCR)检测上皮细胞标志物 E-cad 的 mRNA 表达：RT-PCR 检测上皮细胞标志物 E-cad， APDH 作内参。引物(Sequence 5 3 )： E-cad Sense-TTCTGGAAGGAATGGAGGAGT C-ntisense- ACCTGGAATTGGGCAAATGTG-(147 bp);GAPDH Sense-GGTCTCCTCTGACTTCAACA- Antisense-AGCCAATTCG TTGTCATAC-(115 bp)，引物由上海生工公司合成。加样体系按 试剂盒 Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG 说明书操作。实时定量 PCR 反应条件： 95 5 min 1 个循环，95 20 s,62 30 s,72 30 s，40 个循环。由随机附带软件计算出 Ct 值和拷贝数。 1.8 统计学处理：各实验均重复 3 次，计量资料以均数 标准差(x s)表示，应用 SPSS 16.0 软件处理，多组均数间采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD-t 检验,P 0.05 被认为 是差异有统计学意义。 2 结果 2.1 细胞形态学观察：与不加 TGF- 1 组相比，加入 TGF- 1 后，A549 细胞由鹅卵石状 上皮形态变成梭形、纺锤形，而且其细胞间隙略变大,细胞和细胞之间的连接变得松散。 2.2 间接免疫荧光：荧光显微镜下观察，正常的 A549 细胞为鹅卵石状，细胞表达 E- Cad 蛋白，胞膜可见耀眼的红色荧光染色，在外源性 TGF- 1 刺激下，随时间延长细胞外 形逐渐伸长，并与周围细胞分离，E-Cad 蛋白表达明显减少。 2.3 荧光实时定量 PCR 检测 TGF- 1 对 A549 细胞 E-cad 的 mRNA 表达的影响：与不加 TGF- 1 组相比， A549 细胞在加入 TGF- 1 后其上皮细胞标志物 E-cad 的 mRNA 表达在 24 小时内总体呈现下调趋势，在第 24 h 时间点上最明显(P 0.01)，在第 3 h 时间点上出现一 个短暂反弹(P 0.05)。 3 讨论 EMT 是一种完全分化的上皮细胞经历细胞表型改变转化成完全分化的间质细胞的过程， 通常转化成成纤维细胞和肌纤维母细胞3。EMT 过程很久以来一直被认为在胚胎发育和恶 性肿瘤的细胞转分化中起主导作用。外胚层在早期形成原间质的发育中经历了 EMT 过程。 次级上皮通过间质细胞-上皮转化产生。这些次级上皮然后分化形成完全成熟的上皮，或者 经历第二轮 EMT 形成各种各样的间质细胞和结缔组织细胞，例如脂肪细胞、软骨细胞、 成骨细胞、肌细胞和成纤维细胞4。近年来发现 EMT 可以发生于多种生理、病理过程， 不仅在胚胎发育、肿瘤转移级联反应的早期阶段起重要作用，还促进伤口愈合和多种器官 的纤维化。 正常状态下上皮细胞通过细胞间黏附机制紧密连接在一起，E 钙黏蛋白(E-cadherin) 是 组成上皮细胞间紧密连接的重要成分，在保持细胞完整性和极性中起重要作用。TGF- 1 诱 导的 EMT 早期变化就是 E 钙黏蛋白表达受到抑制，也就是细胞间紧密连接的破坏,上皮细 胞丧失黏附特性，逐渐从基底膜上脱落;然后胞质内细胞骨架进行重排,表达新的表型蛋白如 平滑肌肌动蛋白( -SMA),胞质内肌丝也从上皮型的角蛋白(cytokeratin)转变为间质细胞的波 形蛋白(vimentin)5。细胞形态由鹅卵石状变成梭形，类似成纤维细胞或者肌纤维母细胞， 电镜下可见细胞极性发生改变，微绒毛消失，细胞内出现密体，胞质内出现大量肌动蛋白 微丝。如果细胞在过渡阶段，两类细胞标志可同时表达。这些变化可能为细胞迁徙、收缩 能力增强提供了形态学基础。 本研究中，A549 细胞在 5ng/ml TGF- 1 的诱导下，上皮细胞标志物 E-cad 的 mRNA 表 达在 24 h 内总体呈现下调趋势，在第 24 小时时间点上最明显 ;间接免疫荧光也显示 E-cad 蛋白随时间延长表达减少;这说明 TGF- 1 可以直接诱导肺 EMT 的发生，而且这种作用还存 在时间依赖性。E-cad 在第 3 小时时间点上出现一个短暂反弹推测可能与 TGF- 1 促进 A549 细胞自分泌 TGF- 1 到达一定水平产生的负反馈作用有关。 在很多器官包括肺的纤维化的诱导中，TGF- 1 作为 总开关 被连接在一起6。单是 TGF- 1 在幼鼠和成年鼠肺中的定向表达就可以在微乎其微的炎症下诱导出显著的纤维变性 反应7，而且如前所讨论，TGF- 1 激活障碍可以提供明显的保护作用，阻止博莱霉素在转 基因小鼠中诱导的纤维化8。这一切似乎提示了，正是因为 TGF- 1 在 EMT 的诱导中起到 主导作用，它具有极强的促进上皮细胞表型丧失的能力，因此在肺纤维化的发生中起了关 键作用。 目前，大量涉及 EMT 的研究主要集中在癌转移及肾纤维化上。EMT 在肾纤维化形成中 起到突出的作用，在这一过程中，上皮细胞失去了细胞-细胞附件、极性和上皮细胞的特异 性标记，经历了细胞支架的重塑，而获得间质细胞的表型。本研究用 TGF- 1 诱导 A549 细 胞发生了 EMT，说明肺泡上皮细胞在体外确实可以发生 EMT。但究竟是型肺泡上皮细 胞(AT1) 还是 型肺泡上皮细胞 (AT2)，或者 AT1 和 AT2 两种肺泡上皮细胞都经历了 EMT 仍不确定。可能特定程度的损伤使 AT1 细胞更有可能经历凋亡而 AT2 细胞优先选择了 EMT。在体外实验中，AT2 细胞逐渐表达并获得的所有 AT1 的表型标志，这表明了 AT2 细胞在体外朝 AT1 细胞表型 (类 AT1 细胞) 转分化9-10 。目前的实验条件可以做到将已经 获得 AT1 细胞